目的:建立一種干擾素誘導(dǎo)跨膜蛋白2（IFITM2）基因SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR檢測方法,以期為IFITM2基因的動態(tài)監(jiān)測提供有效的檢測技術(shù).方法:根據(jù)GenBank中公布的IFITM2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,以質(zhì)粒pMD18-T-IFITM2為模板進(jìn)行條件優(yōu)化,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,建立IFITM2基因SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR檢測方法,并對建立的方法進(jìn)行條件優(yōu)化與評價,用建立的方法對腦心肌炎病毒感染后細(xì)胞中IFITM2基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測.結(jié)果:建立的20μL檢測體系中IFITM2基因最佳引物濃度為10μM,最佳退火溫度為59℃;標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在2.62×10⁵～2.62×10¹⁰copies/μL濃度范圍內(nèi)與Ct值呈良好線性關(guān)系,線性方程y=-3.495 logx+43.12,R²=0.998,且靈敏性、特異性和重復(fù)性均較高.應(yīng)用建立的方法對EMCV感染細(xì)胞中IFITM2基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,在感染早期IFITM2轉(zhuǎn)錄水平不變,感染后期轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高.EMCV感染引起宿主IFITM2基... 

【文章來源】：西北民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,41(03)

【文章頁數(shù)】：8 頁

【部分圖文】：

IFITM2基因PCR擴(kuò)增（A）及重組質(zhì)粒的酶切鑒定（B)

通過引物濃度、退火溫度優(yōu)化得出建立的qPCR方法是反應(yīng)體系20 μL:SYBR? Select Master Mix 10.0 μL,ddH2O 6 μL,IFITM2 qF/R(10 μmol/L)各1.0 μL,模板 2.0 μL.反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,59 ℃ 34 s,40次循環(huán).根據(jù)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線得出人源IFITM2基因 SYBR Green I實(shí)時熒光定量PCR 檢測的最佳引物濃度為10 μmol/L(圖2),最佳退火溫度為59 ℃(圖3).圖3 反應(yīng)溫度優(yōu)化

反應(yīng)溫度優(yōu)化

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CD63基因TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的建立及評價[J]. 包曉婧,張海霞,李瓊毅,馬玉梅,令瑛,魏嘉,李向茸,徐雷,馮若飛,馬忠仁.  中國獸醫(yī)科學(xué). 2016(09)
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碩士論文
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本文編號：3145187