林可霉素是林可酰胺類抗生素的重要成員之一。作為臨床上廣泛使用的一類抗菌素,林可霉素通過抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成影響細(xì)菌的生長,因而用于治療各類感染性疾病。雖然通過發(fā)酵工藝的改進(jìn)和菌種的選育可以提高林可霉素的產(chǎn)量,但均具有一定的局限性,而基因工程改造是實(shí)現(xiàn)林可霉素生產(chǎn)能力飛躍的有效策略。林可霉素的生物合成途徑已被初步解析,其調(diào)控機(jī)制也變得逐漸清晰,但負(fù)責(zé)林可霉素生物合成的基因簇（lmb）內(nèi)仍有部分基因功能未知。其中,基因lmbIH和lmbQ生物信息學(xué)預(yù)測其編碼產(chǎn)物屬于PmbA-TldD家族,但作用機(jī)理未知,因此探究lmbIH和lmbQ的功能有望完善林可霉素生物合成與調(diào)控過程,為林可霉素高產(chǎn)菌株的遺傳改造提供操作靶點(diǎn)。為了探究林可霉素簇內(nèi)基因lmbIH和lmbQ的功能,本論文采用CRISPR/Cas介導(dǎo)的鏈霉菌基因組編輯技術(shù),以林肯鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）野生株NRRL2936為出發(fā)菌株,分別構(gòu)建了lmbIH和lmbQ單基因敲除株和雙基因聯(lián)合敲除株。發(fā)酵結(jié)果顯示,lmbIH和/或lmbQ的缺失顯著降低林可霉素的合成,但不影響孢子的形成。同時,為了探測lmbI... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．２?ＰＰＬ生物合成途徑??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?ＰＰＬ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ??ＭＴＬ的生物合成??與ＰＰＬ相比，ＭＴＬ的生物合成途徑更為復(fù)雜，且機(jī)制解析還不夠完善

?事丨丨?－丨丨（丨＾）??ＯＨ?ＯＨ?ＯＨ?ＯＨ?飛川」?〇Ｈ?／）ｐ（）：??Ｏｃｔｏｓｃ?８－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ?Ｏｃｔｏｓｃ?１，８－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｃ??／ＯＨ??人?Ｈ?ｒ?ｒ??＾（）Ｈ?，?？．?ｎ?Ｈｏ?ＬｍｂＬ，Ｍ，Ｓ?ａｎｄ?Ｚ?ｉ，ｎ??ＬｍｂＫ?１｜（）?＂?ｌｍｂｏ?＾Ｃ＾°Ｈ??？＿：？?，ｌ０?１?＾（）Ｈ??ｌ，Ｈ?Ｌ，?＂°?＇?ＯＨ?／?＾??Ｏｃｔｏｓｃ?１?－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ?ＧＤＰ－ｏｃｔｏｓｅ??圖１．３?ＩＶ１ＴＬ生物合成途徑??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?ＭＴＬ?ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｐａｔｈｗａｙ??縮合及修飾過程??林可霉素Ａ生物合成的第三步是ＰＰＬ和ＭＴＬ的縮合及后續(xù)的修飾過程，??該部分的研宄進(jìn)展稍滯。２０１３年Ｌｕｃｉｅ等人１３６１通過體外蛋白表達(dá)及酶活測定等??實(shí)驗(yàn)，證明Ｌｍｂ．ｌ和ＣｃＷ均可將脫甲基林可霉素（ＮＤＬ）轉(zhuǎn)化為林可霉素，??而無需任何其他易形成多聚體結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的幫助，ＬｍＷ不僅能夠轉(zhuǎn)化ＮＤＬ，??而且還能夠轉(zhuǎn)化含有四碳和五碳側(cè)鏈的化合物，此外還提出ＬｍｂＣ在林可霉素??生物合成中可特異性激活ＰＰＬ。２０１５年Ｚｈａｏ等人１３７１發(fā)現(xiàn)了兩種低分丫歟的硫醉??－麥角硫醉（ＥＧＴ）及放線硫氨酸（ＭＳＨ），在林可霉素Ａ的生物合成中均發(fā)揮??了重要作用。在縮合過程中，獨(dú)立的腺苷酸化域ＬｍｂＣ催化４?－丙基－Ｌ－Ｍ氨酸的??活化，ＬｍｂＮ轉(zhuǎn)變成全長的載休蛋「１結(jié)構(gòu)域形式｜３７＿３ｉｉ｜，?ＬｍｂＴ與麥角硫因催化形??成八糖綴合物｜３７１；隨后，該偶聯(lián)物通過酰胺鍵４活化的４＿丙基－Ｌ－脯氨酸在ＬｍｂＤ??催化的下縮合

ｕｃｎ．．ｍ?ＩＩ?１?０?１?⑴?ＳＡＭ?ＳＡＨ??１，０?，Ｉ，ＡＣ?（ｉｌｃ＾ｌｎｓ?｜｜〇Ａｃ?丨丨０?Ｕ：??ｈ?７??ＶＭ?Ｏｉｌ?ＵＨ??１?１，０?０，１?＂?ｙ?ＩＫ）?？ＪＨ?ｙ?ＨＯ?Ｏｉｌ??■以?Ｎ?Ｈ?１?ＬｍｂＦ?Ｍ，Ｃ?Ｎ?ＬｍＷｉ?Ｈ．ｔ?＾??｜ｉ?°?＇?Ｉ?？？＊?Ｉ?｜?〇?Ｓ＂?ＳＡＭ?ＳＡＭ?ｄ?Ｉ?〇?Ｗ??Ｈ〇?ｋ?ＮＨ，．Ｗａ，ｃ?丨丨?〇?ＨＯ??Ｌｉｎｃｏｉｎｖｃｉｎ??Ｘ?９??圖１．４?ＭＴＬ及ＰＰＬ的縮合及修飾途徑??Ｆｉｇｕｒｅ?１．４?ＭＴＬ?ａｎｄ?ＰＰＬ?ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ?ａｎｄ?ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ?ｐａｔｈｗａｙｓ??１．２．３林可霉素生物合成的調(diào)控研宄??經(jīng)過幾十年的研究，林可霉素的合成途徑愈加清晰，但是林可霉素的合成調(diào)??控卻鮮有報道。Ｈｏｕ等人于２０１８年首次提出ＬｍｂＵ作為一種新型的調(diào)控因子，??正調(diào)控林可霉素的合成。轉(zhuǎn)錄分析及新霉素抗性等實(shí)驗(yàn)證實(shí)ＬｍｂＵ可以激活??／ｗＷ／Ｃ／Ｊ／Ｐｆ基因的表達(dá)，抑制／ｗ從／ｔ／基因的表達(dá)［１７丨。同年，Ｈｏｕ等人提出??ｔＲＮＡ?ＢｌｄＡ可以通過翻譯調(diào)節(jié)促進(jìn)林可霉素的產(chǎn)生，揭示了?６／以對林肯鏈霉菌??的形態(tài)分化及林可霉素合成的重要作用［｜２１。Ｘｕ等人Ｉ４２】首次證實(shí)了?ＴｅｔＲ型調(diào)節(jié)??因子ＳＬＣＧ－２９１９可與林可霉素生物合成基因簇的啟動子區(qū)域特異性結(jié)合，通過??抑制簇內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而抑制林可霉素的合成。??在林可霉素的生物合成中，全局調(diào)控因子ＡｄｐＡ、ＢｌｄＤ和ＧｌｎＲ也發(fā)揮了重??要作用：林肯鏈霉菌中ＡｄｐＡ可以直接與其自身啟動子結(jié)合

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Streptomyces lincolnensis新遺傳操作方法的建立以及l(fā)mbQ基因功能研究[J]. 王增亮,趙群飛,高淑紅,陳長華,劉文.  生物技術(shù)通報. 2010(11)
[2]林可霉素生物合成研究進(jìn)展[J]. 張惠展,張長生,周軍.  國外醫(yī)藥(抗生素分冊). 1998(04)



本文編號：3138186