黑曲霉是一種重要的工業(yè)發(fā)酵菌,生長迅速,發(fā)酵周期短,且生長過程中不受雜菌的污染及不產(chǎn)毒素的特點,為符合美國FDA之GRAS公認安全菌株,產(chǎn)酶種類多,產(chǎn)酶能力強,一些極端酶大部分來自于曲霉,由此更加奠定了其在發(fā)酵工業(yè)上的地位。耐酸性α-淀粉酶可補足常用淀粉酶在低pH條件下性能不足的短板,在提高工業(yè)生產(chǎn)廢品的利用和處理、降低原料消耗等方面具有很大的應用潛力與開發(fā)前景,甘露聚糖酶是一種新型的工業(yè)化生產(chǎn)酶,但是由于其發(fā)酵酶活低而導致其成本高,限制了應用范圍,因此,對該酶的研究具有一定的價值。本實驗從新疆某鈾礦酸性浸出液分離得到一株霉菌,本實驗中命名為MJ 5。根據(jù)形態(tài)學特征、rDNA ITS序列分析以及Biolog鑒定系統(tǒng)對該菌株進行鑒定,同時Biolog鑒定板可提供菌株對碳源的消耗情況,由此可分析了解該菌的生長情況及優(yōu)勢碳源。通過對菌株的粗酶液測定α淀粉酶酶活,根據(jù)全基因組測序結(jié)果,設計引物獲得耐酸性α淀粉酶和甘露聚糖酶基因的序列片段,與pPIC9K構(gòu)建表達載體,導入酵母受體細胞進行表達,結(jié)果表明:（1）結(jié)合三種鑒定系統(tǒng)鑒定霉菌MJ 5為黑曲霉Aspergillus niger,霉菌的最適碳... 

【文章來源】：東華理工大學江西省

【文章頁數(shù)】：92 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 黑曲霉
        1.1.1 黑曲霉簡介
        1.1.2 黑曲霉的工業(yè)應用
            1.1.2.1 黑曲霉在檸檬酸生產(chǎn)中的應用
            1.1.2.2 黑曲霉表達系統(tǒng)以及酶制劑生產(chǎn)中的應用
            1.1.2.3 黑曲霉在冶金領域的應用
            1.1.2.4 黑曲霉在養(yǎng)殖業(yè)上的應用
    1.2 耐酸性α-淀粉酶
        1.2.1 耐酸性α-淀粉酶的來源
        1.2.2 耐酸性α-淀粉酶的催化機制
        1.2.3 α-淀粉酶的特性及作用機制
        1.2.4 耐酸性α-淀粉酶的耐酸機制及耐熱性
        1.2.5 α-淀粉酶的酶活測定方法
        1.2.6 耐酸性α-淀粉酶的應用
        1.2.7 耐酸性α-淀粉酶的異源表達
        1.2.8 耐酸性α-淀粉酶的開發(fā)和應用概況
    1.3 甘露聚糖酶
        1.3.1 β-甘露聚糖酶的來源
        1.3.2 β-甘露聚糖酶的酶學性質(zhì)
        1.3.3 β-甘露聚糖酶的異源表達
        1.3.4 國內(nèi)外研究進展
        1.3.5 β-甘露聚糖酶的應用
    1.4 巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）表達系統(tǒng)[95]
        1.4.1 畢赤酵母表達系統(tǒng)研究現(xiàn)狀
        1.4.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)點
        1.4.3 影響外源基因在巴斯德畢赤酵母表達的因素
        1.4.4 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)的應用
    1.5 真菌ITS序列分析與Biolog微生物鑒定系統(tǒng)
    1.6 研究內(nèi)容、目的與意義
第二章 嗜酸性霉菌MJ5的鑒定、碳源分析及所產(chǎn)α淀粉酶的酶學性質(zhì)
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和試劑
        2.1.2 培養(yǎng)基
    2.2 引物合成及測序
    2.3 實驗儀器
    2.4 實驗方法
        2.4.1 菌株的分離、純化與保存
        2.4.2 菌體的形態(tài)學觀察
        2.4.3 rDNAITS序列以及進化樹的構(gòu)建
        2.4.4 Biolog微生物鑒定系統(tǒng)
        2.4.5 在不同培養(yǎng)基下MJ5的產(chǎn)酸情況
        2.4.6 MJ5淀粉酶性質(zhì)的研究
            2.4.6.1 淀粉酶酶活標準曲線的測定
            2.4.6.2 淀粉酶的酶活力測定
            2.4.6.3 MJ5淀粉酶產(chǎn)酶曲線的繪制
            2.4.6.3 MJ5胞外淀粉酶的最適反應溫度
            2.4.6.4 MJ5胞外淀粉酶最適反應pH
            2.4.6.5 MJ5胞外淀粉酶pH穩(wěn)定性和溫度穩(wěn)定性的測定
    2.5 結(jié)果與分析
        2.5.1 MJ5的形態(tài)特征觀察
        2.5.2 rDNAITS序列鑒定結(jié)果
        2.5.3 碳源代謝分析
        2.5.4 不同培養(yǎng)基下的產(chǎn)酸情況
        2.5.5 葡萄糖標準曲線的繪制
        2.5.6 MJ5淀粉酶的產(chǎn)酶曲線
        2.5.7 MJ5淀粉酶的最適溫度
        2.5.8 MJ5淀粉酶的最適pH
        2.5.9 MJ5淀粉酶pH穩(wěn)定性
        2.5.10 MJ5淀粉酶的熱穩(wěn)定性
    2.6 討論
    2.7 小結(jié)
第三章 黑曲霉MJ5（AspergillusnigerMJ5）耐酸性α-淀粉酶基因的克隆與表達
    3.1 實驗材料
        3.1.1 菌株、載體、工具酶和試劑
        3.1.2 引物合成及測序
        3.1.3 培養(yǎng)基及試劑的配制
        3.1.4 實驗儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 黑曲霉MJ5全基因組測序
        3.2.2 耐酸性α-淀粉酶基因的克隆
        3.2.3 耐酸性α-淀粉酶基因cDNA全長序列
        3.2.4 耐酸性α-淀粉酶在畢赤酵母中的表達
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 黑曲霉MJ5全基因組測序結(jié)果
        3.3.2 AspergillusnigerMJ5耐酸性α-淀粉酶基因α-amy-5的擴增
        3.3.3 重組表達載體的構(gòu)建與陽性克隆菌落的鑒定結(jié)果
        3.3.4 耐酸性α-淀粉酶基因α-amy-5基因序列分析
        3.3.5 耐酸性α-淀粉酶基因編碼蛋白序列的糖基化分析
        3.3.6 耐酸性α-淀粉酶基因基因所編碼蛋白的等電點和分子量預測
        3.3.7 重組質(zhì)粒的線性化與α-amy-5重組菌株的篩選
        3.3.8 重組淀粉酶酶活測定結(jié)果
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 黑曲霉MJ5（AspergillusnigerMJ5）甘露聚糖酶基因的克隆與表達
    4.1 實驗材料
        4.1.1 菌株、載體、工具酶和試劑
        4.1.2 引物合成及測序
        4.1.3 培養(yǎng)基及試劑的配制
        4.1.4 實驗儀器
    4.2 實驗方法
        4.2.1 MJ5甘露聚糖酶基因的克隆
        4.2.2 甘露聚糖酶基因cDNA全長序列
        4.2.3 MJ5甘露聚糖酶在畢赤酵母中的表達
        4.2.4 重組甘露聚糖酶的酶學性質(zhì)測定
            4.2.4.1 甘露聚糖酶酶活標準曲線的測定
            4.2.4.2 甘露聚糖酶的酶活力以及比活力的測定
            4.2.4.3 MJ5甘露聚糖酶的最適反應溫度
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 AspergillusnigerMJ5甘露聚糖酶基因man-5的擴增
        4.3.2 重組表達載體的構(gòu)建與陽性克隆菌落的鑒定結(jié)果
        4.3.3 MJ5甘露聚糖酶基因man-5基因序列分析
        4.3.4 MJ5甘露聚糖酶基因編碼蛋白序列的糖基化分析
        4.3.5 MJ5甘露聚糖酶基因基因所編碼蛋白的等電點和分子量預測
        4.3.6 重組質(zhì)粒的線性化與man-5重組菌株的篩選
        4.3.7 MJ5甘露聚糖酶man-5的純化及脫糖基化
        4.3.8 MJ5甘露聚糖酶man-5的酶學性質(zhì)分析
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 結(jié)論與展望
    5.1 結(jié)論
    5.2 展望
參考文獻
致謝
作者攻讀學位期間的科研成果


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3137300