發(fā)布時(shí)間：2021-04-14 03:56

　　胚胎干細(xì)胞的出現(xiàn)打開了生命科學(xué)研究領(lǐng)域一扇新的大門,小鼠胚胎干細(xì)胞系和人胚胎干細(xì)胞系的先后建立為干細(xì)胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的應(yīng)用前景提供了無(wú)限的可能。但是人胚胎干細(xì)胞的發(fā)展面臨著干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)在體外難以維持、現(xiàn)有的培養(yǎng)體系不夠完善、分化變成體細(xì)胞效率低下以及分化機(jī)制不清楚等難題,為了實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的未來(lái)安全有效的轉(zhuǎn)化,現(xiàn)急需解決這些問(wèn)題。通過(guò)發(fā)掘以及解析特定基因在人胚胎干細(xì)胞中的功能及機(jī)制,是解決未來(lái)人胚胎干細(xì)胞多能性的體外維持、干細(xì)胞向特定譜系分化以及干細(xì)胞后續(xù)應(yīng)用于臨床治療等的重要途徑,對(duì)于早日實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化應(yīng)用有著重要的意義。MTA家族蛋白（Metastasis-associated family protein）是一類轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白,它的家族成員最先是從小鼠的乳腺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的。MTA家族基因在多個(gè)的腫瘤細(xì)胞的增殖生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中有著重要的調(diào)控作用,它們表達(dá)量的高低與癌癥病人的存活率有一定的相關(guān)性。MTA家族基因包含有MTA1、MTA2和MTA3三個(gè)主要成員,雖然這三個(gè)基因具有同源性,但是它們?cè)谏砉δ苌嫌幸欢ǖ牟町?此外,還有研究發(fā)現(xiàn)MTA家族基因參與組成NURD（Nucleosome re... 

【文章來(lái)源】：安徽大學(xué)安徽省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

在HES2中，敲低MTA2和MTA3會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞分化

第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果30中過(guò)度表達(dá)這兩個(gè)基因能不能維持HES2的自我更新？為了驗(yàn)證這個(gè)猜想，我們進(jìn)行過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。我們首先合成構(gòu)建了具有FLAG標(biāo)簽序列的PB-MTA2和PB-MTA3的重組質(zhì)粒，為重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染做好了準(zhǔn)備：第一，在HES2中，我們分別構(gòu)建了過(guò)表達(dá)MTA2和MTA3的細(xì)胞株，并進(jìn)行了MTA2和MTA3的蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，曝光機(jī)下的曝光表明，對(duì)照組轉(zhuǎn)入PB質(zhì)粒的細(xì)胞，F(xiàn)LAG抗體并沒(méi)有曝光出來(lái)?xiàng)l帶，而實(shí)驗(yàn)組PB-MTA2和PB-MTA3均有條帶。證實(shí)了在細(xì)胞中MTA2和MTA3蛋白的過(guò)表達(dá)成功（圖1.2A）。第二，我們將得到的過(guò)表達(dá)MTA2和MTA3的細(xì)胞株培養(yǎng)在無(wú)細(xì)胞因子添加的N2B27+KSR培液體系中，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)一周后，與空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的過(guò)表達(dá)細(xì)胞株均全部分化，在實(shí)驗(yàn)觀察中，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)MTA2和MTA3的細(xì)胞株的分化速率比對(duì)照組還要更快一點(diǎn)。過(guò)表達(dá)MTA2和MTA3并不能夠維持HESCs在無(wú)細(xì)胞因子添加的培養(yǎng)基中維持干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)（圖1.2B）。過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了,我們的設(shè)想是錯(cuò)誤的，MTA2、MTA3基因的過(guò)表達(dá)并不能夠維持HESCs的自我更新。圖1.2在HES2中，MTA和MTA2過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)（A）FLAG標(biāo)簽的MTA2和MTA3在HES2中過(guò)度表達(dá)的蛋白質(zhì)免疫印跡分析。α-Tubulin作為對(duì)照組的上樣量。（B）在不添加細(xì)胞因子的培養(yǎng)基下培養(yǎng)下的PB，PB-MTA2和PB-MTA3的HES2細(xì)胞7天后的形態(tài)學(xué)觀察檢測(cè)。Bar，100μm。對(duì)照組為PB組HES2細(xì)胞。3.1.3在H9中，MTA2、MTA3基因的敲低導(dǎo)致H9分化我們?cè)诹硪恢耆伺咛ジ杉?xì)胞系H9，進(jìn)行了重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。在H9中，我們同樣構(gòu)建了敲低MTA2基因和MTA3基因的細(xì)胞株（圖1.3A），形態(tài)學(xué)觀察堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)

安徽大學(xué)碩士學(xué)位論文31（圖1.3B），與HES2中檢測(cè)結(jié)果一致，MTA2，MTA3基因下調(diào)后的H9細(xì)胞的開始分化，失去了堿性磷酸酶活性�？傊�，兩株人胚胎干細(xì)胞系中的這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果共同表明了基因MTA2和MTA3對(duì)維持HESCs的穩(wěn)態(tài)是必要的。圖1.3在H9中，敲低MTA2和敲低MTA3細(xì)胞株的建立與檢測(cè)（A）H9中，敲低MTA2和敲低MTA3的細(xì)胞株中MTA2，MTA3干擾效果的檢測(cè)。數(shù)據(jù)結(jié)果為三次敲低實(shí)驗(yàn)的mean±S.D。*p<0.05,**p<0.01vsscramble。（B）接種在飼養(yǎng)層細(xì)胞上的H9細(xì)胞，培養(yǎng)在含有ActivinA+BFGF培養(yǎng)基中的敲低MTA2細(xì)胞株和敲低MTA3細(xì)胞株5天后的形態(tài)學(xué)觀察和AP染色。Bar，100μm。scramble組遇實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)條件相同。


本文編號(hào)：3136608