胚胎干細胞的出現(xiàn)打開了生命科學研究領域一扇新的大門,小鼠胚胎干細胞系和人胚胎干細胞系的先后建立為干細胞轉(zhuǎn)化醫(yī)學的應用前景提供了無限的可能。但是人胚胎干細胞的發(fā)展面臨著干細胞穩(wěn)態(tài)在體外難以維持、現(xiàn)有的培養(yǎng)體系不夠完善、分化變成體細胞效率低下以及分化機制不清楚等難題,為了實現(xiàn)干細胞的未來安全有效的轉(zhuǎn)化,現(xiàn)急需解決這些問題。通過發(fā)掘以及解析特定基因在人胚胎干細胞中的功能及機制,是解決未來人胚胎干細胞多能性的體外維持、干細胞向特定譜系分化以及干細胞后續(xù)應用于臨床治療等的重要途徑,對于早日實現(xiàn)干細胞的轉(zhuǎn)化應用有著重要的意義。MTA家族蛋白（Metastasis-associated family protein）是一類轉(zhuǎn)移相關蛋白,它的家族成員最先是從小鼠的乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)的。MTA家族基因在多個的腫瘤細胞的增殖生長和侵襲轉(zhuǎn)移過程中有著重要的調(diào)控作用,它們表達量的高低與癌癥病人的存活率有一定的相關性。MTA家族基因包含有MTA1、MTA2和MTA3三個主要成員,雖然這三個基因具有同源性,但是它們在生理功能上有一定的差異;此外,還有研究發(fā)現(xiàn)MTA家族基因參與組成NURD（Nucleosome re... 

【文章來源】：安徽大學安徽省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：77 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

在HES2中，敲低MTA2和MTA3會導致干細胞分化

第三章實驗結(jié)果30中過度表達這兩個基因能不能維持HES2的自我更新？為了驗證這個猜想，我們進行過表達實驗檢測。我們首先合成構(gòu)建了具有FLAG標簽序列的PB-MTA2和PB-MTA3的重組質(zhì)粒，為重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染做好了準備：第一，在HES2中，我們分別構(gòu)建了過表達MTA2和MTA3的細胞株，并進行了MTA2和MTA3的蛋白免疫印跡實驗，曝光機下的曝光表明，對照組轉(zhuǎn)入PB質(zhì)粒的細胞，F(xiàn)LAG抗體并沒有曝光出來條帶，而實驗組PB-MTA2和PB-MTA3均有條帶。證實了在細胞中MTA2和MTA3蛋白的過表達成功（圖1.2A）。第二，我們將得到的過表達MTA2和MTA3的細胞株培養(yǎng)在無細胞因子添加的N2B27+KSR培液體系中，經(jīng)過培養(yǎng)一周后，與空白對照組和實驗組的過表達細胞株均全部分化，在實驗觀察中，我們發(fā)現(xiàn)過表達MTA2和MTA3的細胞株的分化速率比對照組還要更快一點。過表達MTA2和MTA3并不能夠維持HESCs在無細胞因子添加的培養(yǎng)基中維持干細胞的穩(wěn)態(tài)（圖1.2B）。過表達實驗結(jié)果說明了,我們的設想是錯誤的，MTA2、MTA3基因的過表達并不能夠維持HESCs的自我更新。圖1.2在HES2中，MTA和MTA2過表達實驗檢測（A）FLAG標簽的MTA2和MTA3在HES2中過度表達的蛋白質(zhì)免疫印跡分析。α-Tubulin作為對照組的上樣量。（B）在不添加細胞因子的培養(yǎng)基下培養(yǎng)下的PB，PB-MTA2和PB-MTA3的HES2細胞7天后的形態(tài)學觀察檢測。Bar，100μm。對照組為PB組HES2細胞。3.1.3在H9中，MTA2、MTA3基因的敲低導致H9分化我們在另一株人胚胎干細胞系H9，進行了重復驗證試驗。在H9中，我們同樣構(gòu)建了敲低MTA2基因和MTA3基因的細胞株（圖1.3A），形態(tài)學觀察堿性磷酸酶染色發(fā)現(xiàn)

安徽大學碩士學位論文31（圖1.3B），與HES2中檢測結(jié)果一致，MTA2，MTA3基因下調(diào)后的H9細胞的開始分化，失去了堿性磷酸酶活性�？傊�，兩株人胚胎干細胞系中的這些實驗結(jié)果共同表明了基因MTA2和MTA3對維持HESCs的穩(wěn)態(tài)是必要的。圖1.3在H9中，敲低MTA2和敲低MTA3細胞株的建立與檢測（A）H9中，敲低MTA2和敲低MTA3的細胞株中MTA2，MTA3干擾效果的檢測。數(shù)據(jù)結(jié)果為三次敲低實驗的mean±S.D。*p<0.05,**p<0.01vsscramble。（B）接種在飼養(yǎng)層細胞上的H9細胞，培養(yǎng)在含有ActivinA+BFGF培養(yǎng)基中的敲低MTA2細胞株和敲低MTA3細胞株5天后的形態(tài)學觀察和AP染色。Bar，100μm。scramble組遇實驗組培養(yǎng)條件相同。


本文編號：3136608