莨菪（Hyoscyamus niger）屬于茄科的藥用植物,其整個植株含有托品烷生物堿（Tropane alkaloids,TAs）,主要包括莨菪堿和東莨菪堿,可用來作為抗膽堿藥物。由于TAs化學(xué)合成成本過高沒有商業(yè)化前景,因此仍然是從藥源植物中進(jìn)行提取。莨菪堿和東莨菪堿皆可作為抗膽堿藥物,但東莨菪堿比莨菪堿的藥效更優(yōu)且副作用小,因此東莨菪堿的經(jīng)濟(jì)價值更高。托品烷生物堿在植物中含量很低,代謝工程是培育該類生物堿高產(chǎn)藥源植物的重要手段之一,而對TAs生物合成途徑的分子生物學(xué)和生物化學(xué)的研究是開展代謝工程的前題。腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（Putrescine N-methyltransferase,PMT）催化腐胺的N-甲基化形成N-甲基腐胺,是尼古丁和TAs等生物堿的重要前體。大量研究表明,PMT是尼古丁生物合成中的第一個限速酶。但是,PMT在TAs生物合成和調(diào)節(jié)多胺代謝中的研究還有待深入。本研究基于我們實驗室自己測定的莨菪轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（未公布）,篩選到一條編碼腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因,命名為HnPMT。對HnPMT進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析;在大腸桿菌中重組并純化該蛋白,對重組HnPMT采... 

【文章來源】：西南大學(xué)重慶市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

莨菪Fig.1-1Hyoscyamusniger

圖 1-2 茄科植物中托品烷生物堿和多胺生物合成途徑 (強(qiáng)瑋, 2016)紅箭頭表示托品烷合成途徑的反應(yīng)步驟；黑箭頭表示其他代謝途徑反應(yīng)步驟；虛線表示未知或未反應(yīng)或者是多步反應(yīng)；↑表示該基因已經(jīng)在植物中進(jìn)行超表達(dá)；↓表示該基因已經(jīng)在植物中進(jìn)行抑Fig. 1-2 The biosynthetic pathway of tropane alkaloids and polyamines in Solanaceaeed arrows represent reaction steps in TAs biosynthetic pathway. Dark arrows represent reaction steps in oosynthetic pathways. Dashed arrows indicate unknown or unidentified reactions or reactions. ↑ representsoverexpression of the gene in TAs-producing species has been conducted. ↓ represents that suppression osilencing of the gene in TAs-producing species has been conducted.

第 4 章 結(jié)果與分析第 4 章 結(jié)果與分析.1 HnPMT 基因 cDNA 的獲得與分析根據(jù)已經(jīng)報道的煙草等物種的 PMT 核苷酸序列，在莨菪轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（開）中進(jìn)行本地序列比對，篩選出可能參與 TAs 合成的腐胺 N-甲基轉(zhuǎn)移酶（為 HnPMT），通過設(shè)計特異性引物并利用高保真酶進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。由瓊脂膠電泳的結(jié)果（圖 4-1A）可知，PCR 特異性擴(kuò)增產(chǎn)物大小為 1500 bp 左右預(yù)期大小相符。膠回收純化 PCR 產(chǎn)物后，連接 T 載體（pJET1.2）送測序。測序結(jié)果，對HnPMT基因cDNA序列進(jìn)行分析，如圖4-1B所示。獲得的HnPM cDNA 長為 1534 bp，其編碼區(qū)為 1014 bp，編碼 338 個氨基酸殘基的多肽測分子量（MW）為 37 kDa，等電點（pI）為 5.78。


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