L-賴氨酸脫羧酶（L-lysine decarboxylase EC 4.1.1.18）是生物體內(nèi)催化L-賴氨酸發(fā)生脫羧反應(yīng)生成戊二胺的高度專一性酶,需要磷酸吡哆醛（pyridoxal phosphate,PLP）作為輔因子。該酶是生物法合成戊二胺體系中的關(guān)鍵酶。目前,L-賴氨酸脫羧酶酶活力不高、穩(wěn)定性較差等原因是生物合成體系效率低下的瓶頸問題。因此,從環(huán)境微生物中挖掘新型且具有優(yōu)良特性的L-賴氨酸脫羧酶,具有重要的現(xiàn)實意義和工業(yè)應(yīng)用價值。本研究中采用直接提取法構(gòu)建了亞熱帶山區(qū)富含有機質(zhì)土壤的宏基因組文庫。基于功能篩選策略,從文庫中篩選到1個新的L-賴氨酸脫羧酶基因ldc1E（GenBank登錄號:KX463450）,序列分析、功能域分析以及進化關(guān)系分析結(jié)果表明Ldc1E屬于III型磷酸吡哆醛依賴型脫羧酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族。目前,國際上暫未發(fā)現(xiàn)利用宏基因組學(xué)技術(shù)完成新的L-賴氨酸脫羧酶基因功能研究的報道。對ldc1E基因進行克隆,實現(xiàn)其在大腸桿菌表達系統(tǒng)中過量表達,采用Ni-NTA親和層析和超濾脫鹽處理,得到了純度較高的Ldc1E蛋白。產(chǎn)物鑒定結(jié)果表明:Ldc1E具有催化L-賴... 

【文章來源】：廣西大學(xué)廣西壯族自治區(qū) 211工程院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

L-賴氨酸脫羧酶反應(yīng)示意圖

廣西大學(xué)博士學(xué)位論文用于生物合成戊二胺的新的L-賴氨酸脫羧酶基因的功能鑒定和突變研究2中cadA基因編碼酸誘導(dǎo)型L-賴氨酸脫羧酶CadA，cadB基因編碼戊二胺轉(zhuǎn)運蛋白CadB，可將CadA蛋白分泌至胞外，cadC基因編碼的CadC屬于調(diào)控蛋白[12,13]。當(dāng)細(xì)胞處于低pH和L-賴氨酸濃度較高的時候，cadC基因被激活，表達產(chǎn)物作用于Pcad，開始合成CadA和CadB蛋白[14,15]。有研究表明在cadC基因上游發(fā)現(xiàn)的lysP基因編碼的賴氨酸滲透酶LysP對CadC的活性有抑制作用[16]。此外，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)戊二胺的含量較高時可以與CadC結(jié)合，抑制其活性，降低cadBA操縱子的轉(zhuǎn)錄水平；還可以使細(xì)胞膜孔蛋白關(guān)閉，影響細(xì)胞生長[17,18]。圖1-2大腸桿菌中CadBA操縱子的調(diào)控模型[11]Fig.1-2TheregulationmodelofCadoperoninE.coli.目前，來源于大腸桿菌（Escherichiacoli）中的L-賴氨酸脫羧酶CadA和LdcC的酶學(xué)特性研究的較為清楚。其中，LdcC在較寬泛的pH值范圍內(nèi)有活性，最適pH值為7.6，而CadA的最適pH值為5.5；LdcC和CadA在溫度為52°C條件下活性最高，從熱穩(wěn)定性方面來說，LdcC的熱穩(wěn)定性相對較好；在底物親和力上，LdcC與CadA對底物的親和力相當(dāng)[19]。有文獻報道，來源于肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）中的L-賴氨酸脫羧酶CadA和LdcC的最適作用溫度為37°C，最適作用pH為7.0，和大腸桿菌來源的L-賴

廣西大學(xué)博士學(xué)位論文用于生物合成戊二胺的新的L-賴氨酸脫羧酶基因的功能鑒定和突變研究4圖1-3L-賴氨酸脫羧酶的二聚體結(jié)構(gòu)[33]Fig.1-3ThestructureofL-lysinedecarboxylasedimer.L-賴氨酸脫羧酶單體結(jié)構(gòu)可以分為五個部分：Wing結(jié)構(gòu)（紅色）、Linker結(jié)構(gòu)（橘色）、PLP-SD結(jié)構(gòu)（黃色）、SD4結(jié)構(gòu)（綠色）以及CTD結(jié)構(gòu)（藍(lán)色）[33]。單體結(jié)構(gòu)不具有催化活性，只有當(dāng)兩個單體結(jié)合成二聚體時才形成完整的活性中心，即活性中心位于兩個單體結(jié)合時的接觸面。輔因子PLP上的磷酸基團可以與二聚體中的單體1上的T220、S221、S364、H366殘基之間形成氫鍵作用，與單體2上的T398、T399以及S400殘基之間形成氫鍵作用。PLP吡哆環(huán)上的N1可以與D330殘基側(cè)鏈的羧基之間形成鹽鍵[34]。His245的咪唑基團與PLP吡哆環(huán)的re面平行，有助于催化過程中醌型中間體的形成[35]。L-賴氨酸脫羧酶的二聚體可以作為一個結(jié)構(gòu)單元，通過5個結(jié)構(gòu)單元結(jié)合形成十聚合體結(jié)構(gòu)，十聚合體結(jié)構(gòu)中有10個活性中心，可以同時發(fā)生催化反應(yīng)。底物分子進入酶活性中心的通道推測是由CTD結(jié)構(gòu)組成，該通道中含有大量帶負(fù)電荷的Glu殘基，推測其可能對帶正電荷的底物分子具有一定的牽引作用[33]。1.1.5L-賴氨酸脫羧酶的催化機理PLP吡哆環(huán)上的亞胺基與K367位殘基上的ε-氨基共價結(jié)合形成希夫堿，即內(nèi)部醛亞胺；底物分子L-賴氨酸的Cα上的氨基取代K367位的ε-氨基以形成輔酶底物亞胺復(fù)合體，即外部醛亞胺[36]。在反應(yīng)中，輔酶充當(dāng)電子吸收器，儲存來自底物鍵斷裂時的電


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