發(fā)布時間：2021-04-01 10:39

　　漆酶（EC 1.10.3.2,p-diphenol:dioxygen oxidoreductase）是一種含銅氧化還原酶,它能夠催化多種底物并且氧化底物產生的自由基可以進行非酶反應。因此,漆酶在多個工業(yè)領域實際應用中顯示出巨大的潛力。但細菌漆酶在實際應用中中存在產量低等缺點,為了獲得穩(wěn)定性好及染料脫色效率高的細菌漆酶,對前期篩選的具有漆酶活性的菌株LCO1通過形態(tài)特征、生理生化實驗和16S rDNA等方法進行鑒定,并進一步研究其生長特性。采用序列分析和生物信息學軟件對漆酶的氨基酸組成、分子量、等電點及二級結構等進行分析。通過PCR擴增出漆酶基因并構建重組表達載體pPICZαA-lac,使用畢赤酵母菌株進行高效分泌表達,獲得產量較高的漆酶并簡化后續(xù)純化工藝。菌株LCO1的16S rDNA序列長度為1512 bp,鑒定該菌株為短小芽孢桿菌Bacillus pumilus LCO1,該漆酶共有510個氨基酸,分子量58.71,二級結構分析發(fā)現(xiàn)含有25.88%的延伸鏈,60.78%的無規(guī)則卷曲,5.88%的β-轉角和7.45%的α-螺旋。菌株LCO1的最適生長溫度為30℃,最適生長的pH為7.... 

【文章來源】：東北林業(yè)大學黑龍江省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：59 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－２細菌漆酶銅活性位點和電子傳遞過程［２１］??Ｆｉ．?１－２?Ｃｏｅｒ?ｓｉｔｅｓ?ｏｆ?ｂａｃｔｅｒｉａｌ?ｌａｃｃａｓｅ?ａｎｄ?ａ?ｅｌｅｃｔｒｏｎａｔｈｗａ＾２１１??

Ｆｉｇ．?１－４?ｐＰＩＣＺａＡ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??３．１表達載體的選擇??表達載體基本為大腸桿菌／畢赤酵母穿梭載體，大腸桿菌表達載體一般具有大小為１??右的ＡＯＸ１表達組件，如５＇ＡＯＸｌ啟動子，３＇ＡＯＸｌ終止子，啟動子和終止子之間??個或多克隆位點序列（外源編碼序列的插入）等。常用的載體選擇可以根據(jù)蛋白表??置為胞內或者胞外表達或者質粒是否需要進行誘導來選擇合適的表達載體。??３．２表達宿主菌的選擇??常用的畢赤酵母表達宿主菌包括ＳＭＤ１１６８、ＧＳ１１５、ＫＭ７１和ＭＣ１００－３等，大部分??營養(yǎng)缺陷型菌株，在選擇宿主菌時，一些缺乏蛋白酶缺陷性菌株成為表達系統(tǒng)的首??這樣可以減少胞外表達的外源蛋白的降解，提高目的蛋白表達水平，另一方面，宿??所表達的背景蛋白越少越有利于后續(xù)蛋白的分離和純化。??３．３畢赤酵母的高密度發(fā)酵??畢赤酵母表達系統(tǒng)可以實現(xiàn)基因工程菌的高密度發(fā)酵，其過程一般分為兩個階??菌體的擴増階段和甲醇誘導階段。在菌體生長階段，一般以葡萄糖和甘油為碳源的??培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，菌體密度達到一定要求后進入到第二階段，也就是甲醇誘導表達??

?２．３．１．２?菌株?ＬＣ０１?的?１６Ｓ?ｒＤＮＡ?結果??通過細菌基因組提取試劑盒獲得ＬＣ０１基因組ＤＮＡ，電泳結果如圖２－２，基因組獲??得率較高，條帶清晰無降解，質量和濃度能夠滿足實驗需要。１６Ｓ?ｒＤＮＡ電泳結果如圖??２－３。條帶位于１５００?ｂｐ左右，目的ＤＮＡ條帶清晰，帶型完整，沒有彌散，表明ＤＮＡ??樣品純度較高，無降解及核酸酶污染問題。??－１６－??


本文編號：3113197