Dlk1-Dio3印記區(qū)是小鼠基因組中一個重要的印記基因簇,存在多個蛋白編碼基因、長非編碼RNA基因,以及為數(shù)眾多的micro RNA和sno RNA基因。此印記區(qū)間基因的印記表達對于胚胎發(fā)育十分重要。深入研究此印記區(qū)基因的表達調(diào)控及作用機制,對于揭示印記基因在胚胎發(fā)育中的作用及獲取高質量i PS細胞具有重要意義。而目前的研究僅限于三個已知的父本甲基化的差異甲基化區(qū)（IG-DMR,Gtl2-DMR和Dlk1-DMR）對該印記區(qū)的基因表達調(diào)控。因此,尋找和鑒定新的差異甲基化區(qū)對進一步解析此印記區(qū)的基因調(diào)控機制及分子機理具有重要意義。結合本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)的一個新的差異甲基化區(qū)CGI-2,本課題利用新一代基因編輯技術CRISPR/Cas9,建立差異甲基化區(qū)CGI-2敲除小鼠。我們首先設計并制備了用于sg RNA體外轉錄的模板和Cas9體外轉錄模板,然后通過顯微注射方式注射到小鼠受精卵中,并將其培養(yǎng)至囊胚,然后移植到假孕母鼠子宮內(nèi),成功獲得了一只Founder（首建小鼠）。最終移植了64枚囊胚,獲得5只新生小鼠,經(jīng)鑒定,有1只CGI-2單等位敲除的小鼠,總陽性率為20%。我們將Founde... 

【文章來源】：哈爾濱工業(yè)大學黑龍江省 211工程院校 985工程院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

小鼠Dlk1-Dio3印記區(qū)域結構示意圖

圖 1-2 CGI-2 差異甲基化區(qū)的位置CRISPR/Cas9 是最近發(fā)現(xiàn)的一種新型基因組定點編輯技術。CRISPR 是一規(guī)則和短隔行重復序列。它是在大腸桿菌編碼的堿性磷酸酶基因的研究中[10]。它最初存在于含有多個短重復序列的細菌和古細菌的基因組中。它己提供特定的免疫保護機制。入侵外來的元素，如病毒和質粒[11]。CRISP要依靠 crRNA（CRISPR RNA）和 tracrRNA（反式激活嵌合 RNA）組合Cas 蛋白進行外源 DNA 序列特異性降解[12]。在此基礎上，可以在基因組的進行基因打靶，基因插入和基因修復的基因操作。這種新的基因組定點比類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)和鋅指核酸酶(ZFN)技術具有構單快捷、突變效率高、成本低廉、適用范圍廣等許多優(yōu)點，已成為一種因組編輯工具。該技術已成功應用于細菌、人類細胞、斑馬魚、小鼠、猴以及多種植物的基因組精確修飾，是最具有臨床與應用前景的基因治一。所以本課題擬通過利用新一代基因編輯技術 CRISPR/Cas9，建立差區(qū) CGI-2 敲除小鼠并對相關基因印記表達的影響，本研究結果對進一步

圖 1-3 CRISPR/Cas9 原理示意圖CRISPR/Cas 系統(tǒng)的功能可以分為三個階段。第一階段是獲得一個新的間隔二階段是 CRISPR 基因座的表達，包括轉錄和轉錄后處理，第三階段是干擾源基因物質的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)。在開始下一段之前，我們首先解釋兩個名原始間隔序列（原型間隔區(qū)），它是一個間隔序列或質粒序列，與間隔序列。PAM 是原型間隔區(qū) 5'或 3'末端的保守序列，其長度一般為 2-5bp，接近原區(qū)[57]。在不同的菌株或不同類型的 CRISPR/Cas 系統(tǒng)中，PAM 序列和位置的。例如在釀膿鏈球菌中，PAM 序列是 NGG，N 可以是任何核苷酸，沒有差位于原型間隔子的 3'末端[58,59]，而在嗜熱鏈球菌（嗜熱鏈球菌）中，I 型 PA是 AGAAA/ T，其位于 3 '原型間隔的末端[60,61]，II 型的 PAM 序列是 GGNG在原型間隔的 3'末端，在 5'末端。在硫化葉菌中 PAM 序列是 TCC[62]。值得是部分 III 型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的原型間隔器中沒有 PAM 序列。.3.2 CRISPR/Cas9 的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
[1]小鼠Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)一個新的差異甲基化區(qū)的表觀遺傳學分析[D]. 曾鐵波.哈爾濱工業(yè)大學 2015

碩士論文
[1]Dlk1-Dio3印記區(qū)域內(nèi)CGI-2調(diào)控基因表達的研究[D]. 張棲桐.哈爾濱工業(yè)大學 2016



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