目的本次研究主要利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在體外建立SCN1A基因穩(wěn)定敲除的細(xì)胞系并采用RNA-seq分析細(xì)胞的基因表達(dá)譜的變化。通過(guò)檢測(cè)mRNA水平的變化分析SCN1A與DS發(fā)病之間的關(guān)聯(lián),并希望為Dravet綜合癥的治療提供一些線索。方法①根據(jù)SCN1A啟動(dòng)子區(qū)序列設(shè)計(jì)sgRNA,并構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除質(zhì)粒（pX459-SCN1A）。②將pX459-SCN1A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到N2a細(xì)胞系中,采用T7核酸內(nèi)切酶I（T7E1）驗(yàn)證質(zhì)�；钚浴＂蹖X459-SCN1A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HT22細(xì)胞系內(nèi),并構(gòu)建單克隆細(xì)胞系。采用Western-Blot、QPCR檢測(cè)SCN1A敲除效果。④選取SCN1A敲除效率最高的一組細(xì)胞系作為SCN1A-KO組,以HT22細(xì)胞系作為WT組。分別提取兩組細(xì)胞系總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。⑤對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、對(duì)比參考基因組并計(jì)算差異基因。將差異基因進(jìn)行KEGG、GO富集以及蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。選取部分差異基因進(jìn)行QPCR驗(yàn)證。結(jié)果①對(duì)構(gòu)建質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析顯示,設(shè)計(jì)的三段sgRNA成功插入目的位點(diǎn),表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。②T7E1酶切驗(yàn)證顯... 

【文章來(lái)源】：寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回族自治區(qū)

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【圖文】：

圖１質(zhì)粒測(cè)序檢測(cè)??經(jīng)質(zhì)粒測(cè)序檢測(cè)，設(shè)計(jì)的３條ｓｇＲＮＡ已經(jīng)正確插入質(zhì)粒中

３單克隆細(xì)胞系構(gòu)建??采用含８ｐｇ／ｍｌ的ＤＭＥＭ完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞，篩選７ｄ后熒光顯微??鏡下觀察ＥＧＦＰ－ｐＸ４５９質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果顯示，僅轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞存活（見(jiàn)圖３）。從??篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞中挑選單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)構(gòu)建單克隆細(xì)胞系。??圖３陽(yáng)性細(xì)胞篩選??２６??

７差異基因分析??ＷＴ組和ＳＣＮ１Ａ－ＫＯ組相比較，滿足差異塞因篩選條件的基：函：共１８６１個(gè)。與ＷＴ??組相比，ＳＣＮ１Ａ－ＫＯ緝有５７３個(gè)基因Ｊｉ調(diào)，１２８８?jìng)�(gè)基囡下調(diào)（見(jiàn)圖６）。??２８??


本文編號(hào)：3092150