肝纖維化是一種由慢性肝臟損傷引起的病理變化,常見于酒精肝、脂肪肝及病毒性肝炎中。目前關(guān)于肝纖維化影響因子的報(bào)道有很多,但這些因子大多都與骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）的調(diào)控密切相關(guān),BMP9或直接或以調(diào)控通路蛋白的形式間接參與了其中很多分子的轉(zhuǎn)錄、翻譯和激活調(diào)控。BMP9是一種主要由肝臟表達(dá)分泌的生長(zhǎng)分化因子,之前的研究大多集中于其參與干細(xì)胞分化及成骨形成過程,它在肝臟疾病尤其是慢性肝纖維化病程中的作用機(jī)制還鮮有報(bào)道。第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9是一種方便快捷的基因操作工具,它的出現(xiàn)極大地方便了生物科學(xué)研究。此技術(shù)只需針對(duì)靶序列進(jìn)行sgRNA設(shè)計(jì),科研人員就可以對(duì)幾乎所有感興趣的基因進(jìn)行編輯和修飾,從而實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)敲除或敲入。本研究通過胚胎顯微注射bmp9 sgRNA和Cas9 mRNA的方法,成功建立純合的bmp9基因敲除的C57BL/6小鼠,同時(shí)通過優(yōu)化條件建立起成熟的基因敲除動(dòng)物操作體系,為后期闡明BMP9參與調(diào)節(jié)肝纖維化的分子機(jī)制和具體的通路研究奠定基礎(chǔ),也為其它基因修飾動(dòng)物模型的制作提供經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)。研究工作取得如下... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學(xué)陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

bmp9sgRNA設(shè)計(jì)圖例Fig3-1ThesgRNAchosentoknockoutbmp9

4 5 3 4 5 3 4 5 毒質(zhì)粒連接產(chǎn)物sgRNA361 和 sgRNA367 編碼序列分別克隆入 len別對(duì)三個(gè)重組慢病毒質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝之后，核酸電泳結(jié)果顯示，lenti-271、lenti-361、le00bp 的片段（圖 3-2），大小與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相符，說明

分別檢測(cè)三種病毒的 CT 制，帶入標(biāo)曲中計(jì)算其滴度。（見表 3-14）滴度檢測(cè)結(jié)果顯示，包裝的三種敲除慢病毒載體可以用于細(xì)胞的敲除試驗(yàn)。表 3-14 慢病毒滴度測(cè)定結(jié)果Table 3-14 Result of Lentivirus titer慢病毒 滴度（copies/mL）lenti-271 3.14×105lenti-361 3.36×104lenti-367 2.79×1043.3.4慢病毒感染 胞形態(tài)及活力變化用對(duì)照空慢病毒載體和設(shè)計(jì)包裝的三種敲除慢病毒（lenti-271，lenti-361 和 lenti-367）分別感染 L929 細(xì)胞，嘌呤霉素加壓篩選得到陽性克隆，用 CCK-8 法繪制這些陽性克隆細(xì)胞 5 天內(nèi)的生長(zhǎng)曲線，結(jié)果如圖 3-3 所示，結(jié)果表明，敲除組與野生型細(xì)胞組在細(xì)胞生長(zhǎng)活性上沒有明顯變化，形態(tài)也沒有明顯差異，觀察結(jié)果如圖 3-4 所示。說明 bmp9基因敲除后不會(huì)對(duì)細(xì)胞的活性產(chǎn)生顯著的影響。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]應(yīng)用CRISPR/Cas9編輯廣東小耳花豬MSTN基因[J]. 王敏,黃翔,石翾,劉小鳳,曾檢華,劉小紅,陳瑤生,何祖勇.  廣東農(nóng)業(yè)科學(xué). 2017(02)
[2]激素劑量及周齡對(duì)小鼠超數(shù)排卵的影響[J]. 吳銀玲,石夢(mèng)雅,董鑫,周志勇,葛少欽.  醫(yī)學(xué)研究與教育. 2016(02)
[3]周齡和激素水平對(duì)長(zhǎng)爪沙鼠超數(shù)排卵效果的影響[J]. 路靜,朱祥宇,王超,王迎,陳振文,杜小燕.  中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志. 2012(08)
[4]不同激素劑量和組合對(duì)不同品系小鼠超數(shù)排卵的影響[J]. 邱澤文,姜午旗,高麗波,羅光彬,陳軍,詹紅微,高文婷,王靖宇.  中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù). 2011(53)
[5]骨形態(tài)發(fā)生蛋白9誘導(dǎo)成骨相關(guān)TGFβⅡ型受體的鑒定分析[J]. 趙迎澤,張燕,羅進(jìn)勇.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2010(10)
[6]不同激素劑量對(duì)幼鼠超數(shù)排卵及超排卵質(zhì)量的影響[J]. 李子義,譚景和,孫興參,劉忠華,周琪,賀桂馨.  黑龍江畜牧獸醫(yī). 1999(03)



本文編號(hào)：3091846