肝纖維化是一種由慢性肝臟損傷引起的病理變化,常見于酒精肝、脂肪肝及病毒性肝炎中。目前關(guān)于肝纖維化影響因子的報道有很多,但這些因子大多都與骨形態(tài)發(fā)生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）的調(diào)控密切相關(guān),BMP9或直接或以調(diào)控通路蛋白的形式間接參與了其中很多分子的轉(zhuǎn)錄、翻譯和激活調(diào)控。BMP9是一種主要由肝臟表達分泌的生長分化因子,之前的研究大多集中于其參與干細胞分化及成骨形成過程,它在肝臟疾病尤其是慢性肝纖維化病程中的作用機制還鮮有報道。第三代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9是一種方便快捷的基因操作工具,它的出現(xiàn)極大地方便了生物科學研究。此技術(shù)只需針對靶序列進行sgRNA設(shè)計,科研人員就可以對幾乎所有感興趣的基因進行編輯和修飾,從而實現(xiàn)定點敲除或敲入。本研究通過胚胎顯微注射bmp9 sgRNA和Cas9 mRNA的方法,成功建立純合的bmp9基因敲除的C57BL/6小鼠,同時通過優(yōu)化條件建立起成熟的基因敲除動物操作體系,為后期闡明BMP9參與調(diào)節(jié)肝纖維化的分子機制和具體的通路研究奠定基礎(chǔ),也為其它基因修飾動物模型的制作提供經(jīng)驗指導(dǎo)。研究工作取得如下... 

【文章來源】：西北農(nóng)林科技大學陜西省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

bmp9sgRNA設(shè)計圖例Fig3-1ThesgRNAchosentoknockoutbmp9

4 5 3 4 5 3 4 5 毒質(zhì)粒連接產(chǎn)物sgRNA361 和 sgRNA367 編碼序列分別克隆入 len別對三個重組慢病毒質(zhì)粒進行雙酶切，1%瓊脂糖凝之后，核酸電泳結(jié)果顯示，lenti-271、lenti-361、le00bp 的片段（圖 3-2），大小與實驗預(yù)期相符，說明

分別檢測三種病毒的 CT 制，帶入標曲中計算其滴度。（見表 3-14）滴度檢測結(jié)果顯示，包裝的三種敲除慢病毒載體可以用于細胞的敲除試驗。表 3-14 慢病毒滴度測定結(jié)果Table 3-14 Result of Lentivirus titer慢病毒 滴度（copies/mL）lenti-271 3.14×105lenti-361 3.36×104lenti-367 2.79×1043.3.4慢病毒感染 胞形態(tài)及活力變化用對照空慢病毒載體和設(shè)計包裝的三種敲除慢病毒（lenti-271，lenti-361 和 lenti-367）分別感染 L929 細胞，嘌呤霉素加壓篩選得到陽性克隆，用 CCK-8 法繪制這些陽性克隆細胞 5 天內(nèi)的生長曲線，結(jié)果如圖 3-3 所示，結(jié)果表明，敲除組與野生型細胞組在細胞生長活性上沒有明顯變化，形態(tài)也沒有明顯差異，觀察結(jié)果如圖 3-4 所示。說明 bmp9基因敲除后不會對細胞的活性產(chǎn)生顯著的影響。

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3091846