禽大腸桿菌病由于其發(fā)病率高,病原菌血清型多樣對各國禽類養(yǎng)殖業(yè)產生嚴重危害。APEC中的PhoP-PhoQ二元調控系統(tǒng)主要參與調控細菌毒力基因的表達、細菌對Mg2+限制性生長環(huán)境的適應過程、上皮細胞侵襲和抗菌肽抗感染等過程,在禽致病性大腸桿菌致病的過程中發(fā)揮著重要的調控作用。有研究發(fā)現(xiàn)酸性pH、低Mg2+和抗菌肽能夠促進PhoP的磷酸化,激活PhoP蛋白調控的下游靶基因使細菌適應環(huán)境的改變。因此本研究以AE17、△phoP、△phoQ和△phoPQ缺失株為研究對象,以Mg2+濃度,酸性pH和禽β防御素（AvBD9）為培養(yǎng)條件檢測其細菌的體外生長情況。通過制備PhoP兔源多克隆抗體,利用RT-qPCR和Western blot方法檢測不同pH、Mg2+濃度和AvBD9培養(yǎng)環(huán)境中phoP基因轉錄和表達的變化,為進一步研究PhoP在APEC中的調控作用提供理論依據。主要研究內容如下:1.PhoP蛋白表達條件的優(yōu)化及PhoP多克隆抗體的制備與檢測本試驗通過優(yōu)化誘導溫度、IPTG誘導濃度、誘導時間和細菌濃度等條件,篩選出目的蛋白表達量最高的優(yōu)化條件。結果顯示菌液培養(yǎng)至OD600nm為1.0時加入終... 

【文章來源】：安徽農業(yè)大學安徽省

【文章頁數】：71 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖２－９?ＢＣＡ法測定蛋白含量??Ｆｉｇ．９?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?ＢＣＡ?ｍｅｔｈｏｄｓ??

蛋白樣品???濃度（ｆｉｇ／ｍｌ）?ＯＤ５６２?濃度（ｍｇ／ｍｌ）?ＯＤ５６２??０?０．１１１??２５?０．１１９??７５?０．１３１??１２５?０．１４０??３．６２１?１．０４１??２５０?０．１７４??５００?０．２４３??７５０?０．３０５??１０００?０３６６??２．３禽致病性大腸桿菌ＰｈｏＰ蛋白多克隆抗體的檢測??２．３．１雙向瓊脂擴散法檢測兔抗ＰｌｉｏＰ血清效價??２．３．１．１最佳蛋白濃度條件的摸索??雙向瓊脂擴散結果如圖２－丨０，可見在抗原濃度為０．２?ｍｇ／ｍ丨時，仍呈現(xiàn)明顯沉線，??因此，最佳抗原濃度為０．２?ｍｇ／ｍｌ。??２?？．秦?１??圖２－?１０最佳抗原濃度條件的測定??Ｆｉｇ．?２－１０?Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｏｐｔｉｍａｌ?ａｎｔｉｇｅｎ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ??卜６：?ｌ?ｍｇ／ｍｌ、０．８?ｍｇ／ｍｌ、０．６?ｍｇ／ｍｌ、０．４?ｍｇ／ｍｌ、０．３?ｍｇ／ｍｌ、０．２?ｍｇ／ｍｌ；?７：免疫血清??ｌ－６：?ｌ?ｍｇ／ｍｌ，?０．８?ｍｇ／ｍｌ，?０．６?ｍｇ／ｍｌ，?０．４?ｍｇ／ｍｌ，?０．３?ｍｇ／ｍｌ，?０．２?ｍｇ／ｍｌ；?７：?ｉｍｍｕｎｅ?ｓｅｒｕｍ??２．３．１．２血清效價的測定??雙向瓊脂擴散結果如圖２－丨丨，可見在抗體稀釋度為丨：１６時，仍呈現(xiàn)明顯沉線，??兔抗ＰｈｏＰ多克隆抗體效價為１：１６。??２５??

＾＾１??Ｍｇ？８Ｗ??圖２－?１丨雙向瓊脂擴散實驗檢測ＰｈｏＰ多克隆血清效價??Ｆｉｇ．２－１１?Ｄｏｕｂｌｅ?ａｇａｒ?ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ?ｔｅｓｔ?ｏｆ?ＰｈｏＰ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ?ｉｎ?ｒａｂｂｉｔｓ??１：免疫血清原液；２－６：?１：?２、１：?４、１：?８、１：?１６、１：?３２稀釋的免疫血清；７：?ＰｈｏＰ蛋白??１：?ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ；?２－６：?ｒａｂｂｉｔ?ｓｅｒｕｍ?ｄｉｌｕｔｅｄ?ｂｙ?１：２，?１：４，?１：８，?１：１６，?１：３２；?７：?ＰｈｏＰ?ｐｒｏｔｅｉｎ??２＿３＿２?ＥＬＩＳＡ法檢測兔抗ＰｈｏＰ血清效價??用ＥＬＩＳＡ法檢測加強免疫后的兔血清抗體效價，免疫后血清效價吸光度與免疫??前血清效價吸光度比值大于２，則判斷為陽性。兔子經過４次免疫后，獲得ＰｈｏＰ蛋??白抗血清，經ＥＬＩＳＡ法檢測，其效價可達到１：２０９７１５２００，如圖２－１２所示。??５０．０??４５．０?？—???４０．０??§?３５．０?＼??ｇ?３。．。?＼??＾?２５．０?＇??＾?２０－°?＼??窆?１５．０?????１〇＇°?？??Ｊ?———??４００００?１６００００?６４００００?２５６００００?１０２４００００?４０９６００００?１６３８４００００?６５５３６００００??抗體稀釋度??圖２－?１２兔抗ＰｈｏＰ蛋白多克隆抗體效價曲線??Ｆｉｇ．２－１２?Ｔｈｅ?ｃｕｒｖｅ?ｏｆ?ｒａｂｂｉｔ?ａｎｔｉ－ＰｈｏＰ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｙ?ｔｉｔｅｒ??２．３．３兔抗ＰｈｏＰ血清的


本文編號：3087896