農(nóng)田雜草與作物競爭生長空間、光照、水、土壤、養(yǎng)分等資源,形成草害,導(dǎo)致作物減產(chǎn)并造成嚴重經(jīng)濟損失。隨著殺草譜廣、活性高、除草效果好且對環(huán)境友好的除草劑被不斷成功研發(fā)應(yīng)用,除草劑使用面積不斷擴大,已成為農(nóng)田雜草治理主要方式。但是,除草劑導(dǎo)致農(nóng)作物藥害事故頻發(fā),成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)亟待解決的重要問題之一。通過常規(guī)與生物技術(shù)方法培育除草劑抗性作物品種為該問題的解決提供了有效途徑。常規(guī)除草劑抗性育種受限于難以篩選與發(fā)現(xiàn)稀有的突變。轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)則需要復(fù)雜且時間和經(jīng)濟成本高昂的環(huán)境與生物安全審批流程以及跨國公司對該領(lǐng)域?qū)＠募夹g(shù)壟斷。因此,通過基因編輯技術(shù)定點突變玉米等作物的內(nèi)源基因培育抗性品種,具有重大的產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景與價值。本研究以玉米（Zea mays L.）乙酰乳酸合成酶基因（ZmALS1和ZmALS2）為靶基因,構(gòu)建了胞嘧啶單堿基編輯工具,通過精確單堿基編輯的方式將玉米ZmALS1和ZmALS2中第165位脯氨酸替換為絲氨酸,在不影響支鏈氨基酸合成代謝活性的情況下,降低其對氯磺隆除草劑的敏感性,創(chuàng)制氯磺隆除草劑抗性玉米種質(zhì)。主要結(jié)果如下:1、以殘基肽XTEN為銜接物將大鼠胞嘧啶脫氨酶（APOBE... 

【文章來源】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京市

【文章頁數(shù)】：44 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

ZmALS1和ZmALS2基因sgRNA設(shè)計

圖 2.2 ALS-CBE 載體圖譜Figure 2.2 ALS-CBE vector map.2.3 載體遺傳轉(zhuǎn)化和陽性植株鑒定構(gòu)建完成的質(zhì)粒的遺傳轉(zhuǎn)化的步驟如下：（1）ALS-CBE 載體轉(zhuǎn)化 BMEHA105 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞以獲得重組農(nóng)桿菌；（2）N6 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)重組農(nóng)桿菌至菌液 OD600nm為 0.8；（3）菌液于 5000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心 10 min，收集菌體；（4）侵染緩沖液懸浮菌體，使 OD600nm為 0.5 左右；（5）28℃，150 rpm 條件下震蕩培養(yǎng) 30 min 即用于侵染;（6）選取狀態(tài)良好的愈傷組織在侵染緩沖液中浸泡 1 h；（7）轉(zhuǎn)至上述（5）侵染液中浸泡 15 min，棄菌液并用濾紙吸干多余菌液；（8）將上述（6）中的愈傷組織置于固體共培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng) 10 天；（9）轉(zhuǎn)至含有草甘膦的恢復(fù)培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng) 7 天篩選出陽性愈傷組織；（10）將上述（8）陽性愈傷組織轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)胚狀體培養(yǎng)基 28℃暗培養(yǎng) 14 天；（11）將上述（9）中胚狀體轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至幼苗長到一定高度，暴露于空氣中，3

20圖 3.1 T1 代轉(zhuǎn)基因植株中 ZmALS1 靶位點突變譜Figure 3.1 Mutation profile of ZmALS1 target site in T1 transgenic plants ：WT 野生型。序列圖中橫線部分為 sgRNA,紅色標記字母為 PAM。綠色標記字母表示靶標替換為 T,其他替換用藍色字母表示。峰中不同堿基用不同顏色的峰表示，虛線框內(nèi)是堿基替換發(fā)生的部位，黃色陰影為 PAM。ote：WT wild type. In the sequence diagram, the cross-hatched portion is sgRNA, the red-marked letter is PAM. The green-marked letterdicates that it is replaced with T, and the other replacements are indicated by blue letters. The different bases in the peak map are represented byaks of different colors. The dotted line is the part where the base substitution occurs, and the yellow shade is PAM..3 突變植株氯磺隆除草劑抗性表型鑒定.3.1 氯磺隆除草劑有效作用濃度梯度篩選玉米出苗后的第三周，使用 5 個梯度濃度氯磺隆噴施處理玉米苗，并設(shè)置一個陰性對照。四后觀察玉米苗表型：不同濃度處理下玉米苗生長狀況不同。如圖 3.2 所示，100 mg/L 處理下的株完全枯萎死亡，因此將 100 mg/L 作為氯磺隆的有效作用濃度。

【參考文獻】：
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本文編號：3069658