發(fā)布時間：2021-03-07 19:15

　　農田雜草與作物競爭生長空間、光照、水、土壤、養(yǎng)分等資源,形成草害,導致作物減產并造成嚴重經濟損失。隨著殺草譜廣、活性高、除草效果好且對環(huán)境友好的除草劑被不斷成功研發(fā)應用,除草劑使用面積不斷擴大,已成為農田雜草治理主要方式。但是,除草劑導致農作物藥害事故頻發(fā),成為農業(yè)生產亟待解決的重要問題之一。通過常規(guī)與生物技術方法培育除草劑抗性作物品種為該問題的解決提供了有效途徑。常規(guī)除草劑抗性育種受限于難以篩選與發(fā)現稀有的突變。轉基因生物技術則需要復雜且時間和經濟成本高昂的環(huán)境與生物安全審批流程以及跨國公司對該領域專利的技術壟斷。因此,通過基因編輯技術定點突變玉米等作物的內源基因培育抗性品種,具有重大的產業(yè)應用前景與價值。本研究以玉米（Zea mays L.）乙酰乳酸合成酶基因（ZmALS1和ZmALS2）為靶基因,構建了胞嘧啶單堿基編輯工具,通過精確單堿基編輯的方式將玉米ZmALS1和ZmALS2中第165位脯氨酸替換為絲氨酸,在不影響支鏈氨基酸合成代謝活性的情況下,降低其對氯磺隆除草劑的敏感性,創(chuàng)制氯磺隆除草劑抗性玉米種質。主要結果如下:1、以殘基肽XTEN為銜接物將大鼠胞嘧啶脫氨酶（APOBE... 

【文章來源】：中國農業(yè)科學院北京市

【文章頁數】：44 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

ZmALS1和ZmALS2基因sgRNA設計

圖 2.2 ALS-CBE 載體圖譜Figure 2.2 ALS-CBE vector map.2.3 載體遺傳轉化和陽性植株鑒定構建完成的質粒的遺傳轉化的步驟如下：（1）ALS-CBE 載體轉化 BMEHA105 農桿菌感受態(tài)細胞以獲得重組農桿菌；（2）N6 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)重組農桿菌至菌液 OD600nm為 0.8；（3）菌液于 5000 rpm 轉速下離心 10 min，收集菌體；（4）侵染緩沖液懸浮菌體，使 OD600nm為 0.5 左右；（5）28℃，150 rpm 條件下震蕩培養(yǎng) 30 min 即用于侵染;（6）選取狀態(tài)良好的愈傷組織在侵染緩沖液中浸泡 1 h；（7）轉至上述（5）侵染液中浸泡 15 min，棄菌液并用濾紙吸干多余菌液；（8）將上述（6）中的愈傷組織置于固體共培養(yǎng)基中，28℃暗培養(yǎng) 10 天；（9）轉至含有草甘膦的恢復培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng) 7 天篩選出陽性愈傷組織；（10）將上述（8）陽性愈傷組織轉至誘導胚狀體培養(yǎng)基 28℃暗培養(yǎng) 14 天；（11）將上述（9）中胚狀體轉至分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至幼苗長到一定高度，暴露于空氣中，3

20圖 3.1 T1 代轉基因植株中 ZmALS1 靶位點突變譜Figure 3.1 Mutation profile of ZmALS1 target site in T1 transgenic plants ：WT 野生型。序列圖中橫線部分為 sgRNA,紅色標記字母為 PAM。綠色標記字母表示靶標替換為 T,其他替換用藍色字母表示。峰中不同堿基用不同顏色的峰表示，虛線框內是堿基替換發(fā)生的部位，黃色陰影為 PAM。ote：WT wild type. In the sequence diagram, the cross-hatched portion is sgRNA, the red-marked letter is PAM. The green-marked letterdicates that it is replaced with T, and the other replacements are indicated by blue letters. The different bases in the peak map are represented byaks of different colors. The dotted line is the part where the base substitution occurs, and the yellow shade is PAM..3 突變植株氯磺隆除草劑抗性表型鑒定.3.1 氯磺隆除草劑有效作用濃度梯度篩選玉米出苗后的第三周，使用 5 個梯度濃度氯磺隆噴施處理玉米苗，并設置一個陰性對照。四后觀察玉米苗表型：不同濃度處理下玉米苗生長狀況不同。如圖 3.2 所示，100 mg/L 處理下的株完全枯萎死亡，因此將 100 mg/L 作為氯磺隆的有效作用濃度。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]2016年全球生物技術/轉基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J].   中國生物工程雜志. 2017(04)
[2]ACCase抑制除草劑及雜草對其抗性的發(fā)展與治理[J]. 蘇少泉.  農藥. 2015(06)
[3]淺談玉米田草害成因及其防治的方法[J]. 王斌.  中國新技術新產品. 2015(09)
[4]水稻田間常見雜草的發(fā)生及其防治[J]. 楊麗娟.  吉林農業(yè). 2014(07)
[5]除草劑及抗除草劑作物的應用現狀與展望[J]. 陳海偉,張魯華,陳德富,陳喜文.  生物技術通報. 2012(10)
[6]乙酰乳酸合成酶抑制型除草劑抗性作物的創(chuàng)制與發(fā)展[J]. 蘇少泉.  世界農藥. 2011(03)
[7]原卟啉原氧化酶抑制性除草劑的發(fā)展[J]. 蘇少泉.  農藥研究與應用. 2011(01)
[8]植物轉基因技術的誕生和發(fā)展[J]. 楊長青,王凌健,毛穎波,陳曉亞.  生命科學. 2011(02)
[9]我國雜草學研究現狀及其發(fā)展策略[J]. 強勝.  植物保護. 2010(04)
[10]非轉基因抗除草劑作物研究現狀與展望[J]. 陶波,張洪巖,張慶賀,韓玉軍.  植物保護學報. 2010(03)



本文編號：3069658