發(fā)布時(shí)間：2021-03-07 02:52

　　三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]為人參屬藥用植物,具有悠久的藥用歷史。三七皂苷（Panax notoginseng saponins,PNS）是三七主要的活性成分,在防治心腦血管疾病方面作用顯著。由于三七藥材為多年生植物,種植需要輪作,土地利用率低,因此有必要深入研究三七皂苷的生物合成調(diào)控技術(shù),為利用合成生物學(xué)生產(chǎn)藥用皂苷提供理論依據(jù)和技術(shù)基礎(chǔ)。三七皂苷主要由甲羥戊酸（MVA）途徑合成,該皂苷合成途徑中,存在植物甾醇副產(chǎn)物合成支路,分流皂苷合成代謝流。因此,植物甾醇合成支路的第一個(gè)關(guān)鍵酶“環(huán)阿屯醇合成酶（cycloartenol synthase,CAS）”雖然不直接影響三七皂苷的合成,但由于它與達(dá)瑪烯二醇合成酶（dammarenediol-II synthase,DS）共享合成皂苷的前體2,3-氧化鯊烯（2,3-oxidosqualene）,因此通過調(diào)控CAS表達(dá),可以間接影響皂苷的合成。此外,我們的前期研究表明轉(zhuǎn)錄因子能夠影響直接參與三七皂苷合成的關(guān)鍵酶基因的表達(dá),進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)皂苷合成代謝流的調(diào)控。本研究利用轉(zhuǎn)錄因子獨(dú)有的“多點(diǎn)調(diào)控”優(yōu)勢(shì),同時(shí)... 

【文章來源】：昆明理工大學(xué)云南省

【文章頁數(shù)】：86 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

三七皂苷的生物合成途徑（圖中虛線表示多步酶促反應(yīng)）

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文16篩選陽性單克隆菌液。將陽性菌液送生工生物公司測序，以獲得正確的PnbHLH基因開放閱讀框。2.3.4PnbHLH基因生物信息學(xué)分析DNAMAN軟件用于進(jìn)行DNA多重序列相似性比對(duì)；利用軟件MEGA6.0構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹用于分析PnbHLH的系統(tǒng)發(fā)育多樣性；PnbHLH基因編碼蛋白的理化性質(zhì)分析通過在線分析軟件ExPASyBioinformaticsResourcePortal中的ProteomicsProtparam(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)完成；PnbHLH蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)通過軟件PredictProtein(https://www.predictprotein.org/)進(jìn)行預(yù)測，三維結(jié)構(gòu)通過SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行預(yù)測。2.4結(jié)果與分析2.4.1三七細(xì)胞總RNA的提取和純化通過完整的三七總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，所提取的RNA條帶均含有清晰的三條帶，從上到下依次為28SrRNA、18SrRNA以及5SrRNA，且28SrRNA的條帶亮度比18SrRNA條帶亮(圖2.1)；紫外分光光度計(jì)檢測所提三七總RNA濃度發(fā)現(xiàn)A260/A280比值都在在1.8-2.0之間，這表明RNA中可能夾帶蛋白等其他雜質(zhì)，但濃度在該范圍內(nèi)仍舊可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的操作[49]；A260/A230比值均在2.08左右，說明所提取的三七總RNA質(zhì)量較好，純度較高。另外，水飽和酚有除蛋白的作用，氯仿可以有效去除蛋白和使有機(jī)相和水相分開，如果所提植物組織中存在蛋白等雜質(zhì)含量較多的情況，可以在用苯酚氯仿抽提蛋白的步驟中適當(dāng)重復(fù)一至兩次進(jìn)一步純化RNA。圖2.1三七總RNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.2.1AgarosegelelectrophoresisanalysisoftotalRNAofP.notoginseng

第二章三七PnbHLH轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與分析172.4.2克隆獲得PnbHLH基因以上述所提三七愈傷組織RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈為模板擴(kuò)增得到三七PnbHLH基因的ORF框。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果如圖2.2所示，在1000bp左右存在清晰的條帶，條帶大小與目的基因大小相符。根據(jù)膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，電泳檢測回收條帶正確；將回收的目的基因產(chǎn)物連接pMD18-T載體隨后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，挑單克隆搖菌并編號(hào)，以菌液為模板、所設(shè)計(jì)的PnbHLH-F/R為引物進(jìn)行菌液PCR陽性檢測，圖2.3所示2-7號(hào)菌液在大約1000bp處均有明亮的條帶。選取編號(hào)為2、3及6號(hào)單克隆菌液送測序，將測序結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室先前序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)6號(hào)菌液序列相似性為99.74%，只有747bp處的一個(gè)堿基不同，表明所克隆的PnbHLH基因開放閱讀框序列是正確的，大小為966bp。圖2.2PnbHLH基因條帶檢測(1，2：PnbHLH基因；M：DNAMarkerDL2501)Fig.2.2PnbHLHfull-lengthproduct(1,2:PnbHLHgene;M:DNAMarkerDL2501)圖2.3pMD18-T-PnbHLH大腸桿菌菌液PCR(M：DNAMarkerDL2501；1：陰性對(duì)照；2-7：菌液樣品)Fig.2.3BacterialiquidPCRofpMD18-T-PnbHLHE.coli(M:DNAMarkerDL2501;1:Negativecontrol;2-7:Sampleofbacterialiquid)

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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