天然免疫是機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線。TANK結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1,TBK1）是病毒感染時IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干擾素表達的關(guān)鍵激酶,在抗病毒天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。為研究TBK1在偽狂犬病毒復(fù)制過程中的作用,本試驗利用慢病毒介導(dǎo)的CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了豬TBK1基因穩(wěn)定敲除豬腎細胞系。首先針對TBK1基因外顯子2區(qū)設(shè)計3條單鏈向?qū)NA（Single guide RNA,sgRNA）并在退火后將其連接到經(jīng)Bsmb Ⅰ核酸內(nèi)切酶切割過的載體質(zhì)粒LentiCRISPR v2上得到重組質(zhì)粒,然后將重組質(zhì)粒和pMD2.G、psPAX2兩種包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至人胚腎細胞HEK293T/17獲取慢病毒并感染豬腎細胞（Porcine kidney 15,PK15）。用含嘌呤霉素（Puromycin）的培養(yǎng)基壓力篩選獲得TBK1基因敲除多克隆細胞系后提取細胞基因組,PCR擴增目的片段并將擴增產(chǎn)物退火,然后用T7核酸內(nèi)切酶檢測三條sgRNA的編輯效率。選取編輯效率最高的多克隆細胞系通過有限稀釋法,獲得TBK1基因敲除單克隆細胞... 

【文章來源】：河南農(nóng)業(yè)大學河南省

【文章頁數(shù)】：41 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
致謝
英文縮略表
摘要
1 文獻綜述
    1.1 天然免疫概述
    1.2 模式識別受體（PRRs）
        1.2.1 DNA識別受體
        1.2.2 RNA識別受體
        1.2.3 Toll樣識別受體（TLRs）
    1.3 病原相關(guān)分子模式與損傷相關(guān)分子模式
        1.3.1 病原相關(guān)分子模式（PAMP）
        1.3.2 損傷相關(guān)分子模式（DAMP）
    1.4 IFN與IFN信號通路
        1.4.1 IFN簡介及分類
        1.4.2     IFN的功能
        1.4.3 IFN信號通路
    1.5 TBK1與天然免疫
        1.5.1 TBK1結(jié)構(gòu)與功能
        1.5.2 TBK1在天然免疫中的作用
    1.6 偽狂犬病
        1.6.1 偽狂犬病
        1.6.2 偽狂犬病毒
        1.6.3 PRV與天然免疫
    1.7 CRISPR/Cas9技術(shù)簡介
        1.7.1 CRISPR/Cas9技術(shù)
        1.7.2 CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用
        1.7.3 CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)點與不足
    1.8 展望
2 引言
3 材料與方法
    3.1 材料
        3.1.1 細胞與病毒
        3.1.2 質(zhì)粒及感受態(tài)
        3.1.3 試劑及耗材
    3.2 方法
        3.2.1 引物設(shè)計與合成
        3.2.2 sgRNA/Cas9表達載體的構(gòu)建
        3.2.3 慢病毒包裝及多克隆細胞系的構(gòu)建
        3.2.4 T7核酸內(nèi)切酶檢測
-/-單克隆細胞系的構(gòu)建">        3.2.5 PK15-TBK1^-/-單克隆細胞系的構(gòu)建
        3.2.6 CCK-8細胞活力檢測
        3.2.7 熒光觀察及流式檢測
        3.2.8 Real-time Quantitative PCR （RT-qPCR）
        3.2.9 Western blot檢測PRV gB和PRV gE蛋白的表達
50)">        3.2.10 PRV子代病毒感染力測定(TCID₅₀)
        3.2.11 統(tǒng)計學分析
4 結(jié)果
    4.1 TBK1基因敲除細胞系的構(gòu)建
    4.2 TBK1基因敲除對PK15細胞活力的影響
    4.3 TBK1基因敲除對PRV-GFP病毒復(fù)制的影響
    4.4 TBK1基因敲除對PRV gB、gE、TK基因轉(zhuǎn)錄的影響
    4.5 TBK1基因敲除對PRV gB和PRV gE蛋白表達的影響
    4.6 TBK1基因敲除對PRV子代病毒感染力的影響
    4.7 TBK1基因敲除對IL-1β、IFN-β及ISG15基因轉(zhuǎn)錄的影響
5 討論與結(jié)論
    5.1 討論
    5.2 結(jié)論
參考文獻
Abstract


【參考文獻】：
期刊論文
[1]干擾素抗病毒效力影響因素的研究進展[J]. 甘霖,趙俊,陳敬賢,王明麗.  微生物與感染. 2018(01)
[2]RIG-Ⅰ對Ⅰ型干擾素信號通路的調(diào)控[J]. 穆曉玲.  農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究. 2018(01)
[3]CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的應(yīng)用研究進展[J]. 陳怡李,姚書忠.  國際生殖健康/計劃生育雜志. 2017(06)
[4]CRISPR/Cas9技術(shù)在代謝性疾病研究中的應(yīng)用進展[J]. 胡依萌,徐焱成.  山東醫(yī)藥. 2017(02)
[5]TANK結(jié)合激酶1在抗病毒免疫應(yīng)答中的作用研究進展[J]. 王雪,張毓川,陳瑋.  浙江大學學報(醫(yī)學版). 2016 (05)
[6]病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式在免疫炎癥反應(yīng)中的作用[J]. 丁燁,任靜宜,于洪強,周延民,于維先.  國際口腔醫(yī)學雜志. 2016(02)
[7]IKKε/TBK1信號通路調(diào)控與致癌作用的研究進展[J]. 唐人民,李俊明,鄒秀蘭.  中國老年學雜志. 2015(23)
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[9]病原體相關(guān)分子模式與免疫識別受體研究進展[J]. 陶志云,施祖灝,朱春紅,宋衛(wèi)濤,宋遲,秦愛建.  中國免疫學雜志. 2014(05)
[10]仔豬偽狂犬病母源抗體消長規(guī)律的研究[J]. 孟慶利,徐利,石國魁,張碩.  養(yǎng)豬. 2014(01)

博士論文
[1]蛋白激酶Mst1調(diào)控抗病毒宿主防御的功能與機制研究[D]. 孟凡森.浙江大學 2017

碩士論文
[1]偽狂犬病毒gB蛋白單抗的制備及夾心ELISA檢測PRV方法的建立[D]. 王方.吉林大學 2017
[2]巨噬細胞源性外泌體對脂肪細胞胰島素敏感性的調(diào)節(jié)[D]. 鄭雅文.蘇州大學 2017
[3]偽狂犬病毒gB基因在畢赤酵母中的表達及初步應(yīng)用[D]. 朱淑芬.山東農(nóng)業(yè)大學 2012



本文編號：3067080