發(fā)布時(shí)間：2021-03-04 18:53

　　[目的]克隆絲瓜籽Luffin-α基因,優(yōu)化其在大腸桿菌中可溶性表達(dá)的條件,并進(jìn)行初步的抗腫瘤活性測(cè)定。[方法]采用反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）的方法克隆獲得絲瓜籽Luffin-α基因,構(gòu)建p GEX6P-1/Luffin-α表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中獲得重組菌株,摸索不同異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）濃度、誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白可溶性表達(dá)的影響。以谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase,GST）親和層析方法純化目標(biāo)蛋白,并使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western blot對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)及鑒定。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（methylazo salt trace enzyme reaction colorimet... 

【文章來(lái)源】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào). 2020,44(08)

【文章頁(yè)數(shù)】：8 頁(yè)

【部分圖文】：

RT-PCR擴(kuò)增絲瓜籽Luffin-α基因

將上述克隆獲得的Luffin-α基因通過(guò)酶切、連接方式克隆到pGEX6P-1載體的Bam HI和EcoRI位點(diǎn)處。將獲得的重組質(zhì)粒（pGEX6P-1/Luffin-α）進(jìn)行雙酶切鑒定，1%瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，雙酶切（Bam HI和Eco RI）產(chǎn)物出現(xiàn)一條大小約為800bp的條帶，與目的條帶大小一致。見(jiàn)圖2。進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證后表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.3 重組蛋白的初步表達(dá)鑒定

在誘導(dǎo)溫度為16℃，IPTG終濃度分別為0.3、0.5、0.8、1mmol·L-1的條件下分別誘導(dǎo)20h。SDS-PAGE電泳圖顯示重組可溶性蛋白Luffin-α均有表達(dá)，但I(xiàn)PTG終濃度為0.8、1mmol·L-1的表達(dá)量比IPTG終濃度為0.3、0.5mmol·L-1的多，且由于IPTG終濃度為0.8和1mmol.L-1時(shí)表達(dá)量較為接近。見(jiàn)圖4。因此，選用0.8mmol·L-1作為誘導(dǎo)Luffin-α基因可溶性表達(dá)的最佳IPTG濃度。圖4 IPTG濃度對(duì)Luffin-α重組蛋白原核表達(dá)的影響

【參考文獻(xiàn)】：
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