本文關(guān)鍵詞：稻瘟病菌MoSom1剪切異構(gòu)體、PKA磷酸化位點(diǎn)及含LisH模體蛋白編碼基因的功能分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：稻瘟病是世界水稻產(chǎn)區(qū)最重要的病害之一,而稻瘟病菌是研究植物與病原互作的模式病原真菌。了解稻瘟病菌的致病分子機(jī)理對殺菌劑的研發(fā)和病害的有效防控具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室先前的研究發(fā)現(xiàn),稻瘟病菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子MoSoml作用于cAMP-PKA信號途徑下游,調(diào)控稻瘟病菌的形態(tài)分化和致病過程。本文對稻瘟病菌MoSom1剪切異構(gòu)體、PKA磷酸化位點(diǎn)及含LisH模體蛋白編碼基因的功能進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究,取得以下結(jié)果：1.稻瘟病菌MoSom1不同剪切異構(gòu)體具有相同的生物學(xué)功能。用MoSOM1的6種不同剪切方式序列回補(bǔ)Δmosom1突變體的結(jié)果顯示,不同剪切方式回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子的生長、產(chǎn)孢和致病性均能恢復(fù)到野生型水平,可見,MoSOM1的不同剪切方式不影響其正常的生物學(xué)功能。2.稻瘟病菌MoSom1的S227氨基酸殘基是一個(gè)關(guān)鍵的PKA磷酸化位點(diǎn)。生物信息學(xué)分析顯示,稻瘟病菌MoSom1中含8個(gè)預(yù)測的PKA磷酸化S/T殘基,分別為T151、S188、S227、S228、S512、T603、T629和S642。對這些殘基的缺失突變結(jié)果顯示,只有MoSOM1ΔS227,228缺失突變體表型和致病性不能恢復(fù)到野生型。進(jìn)一步對S227和S228的替換(A or E)突變結(jié)果顯示,MoSOM1S227E、MoSOM1S228A和MoSOM1S228E的表型與野生菌株一致,而MoSOM1S227A的表型和致病性不能恢復(fù)。上述結(jié)果證實(shí),稻瘟病菌MoSoml的S227殘基是一個(gè)關(guān)鍵的PKA磷酸化位點(diǎn)。3.稻瘟病菌中編碼含LisH模體蛋白基因的功能分析。稻瘟病菌MoSoml含一個(gè)保守的LisH模體。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在稻瘟病菌基因組中總共有7個(gè)含LisH模體蛋白的編碼基因,除已報(bào)道的MGG_04708 (MoSOMl)和MGG_03198 (TIGI)外,其余的MGG_01665、MGG_06742、 MGG_00753、MGG_04137和MGG_09369還未見有研究報(bào)道,為探索這些基因的生物學(xué)功能,我們展開了對上述5個(gè)基因的敲除工作。目前已分別獲得MGG_01665、MGG_00753和MGG 04137基因的敲除突變體,ΔMGG_01665和ΔMGG_04137突變體的表型(包括生長、形態(tài)分化和致病力)與野生型菌株相似,而ΔMGG_00753突變體對寄主的致病力有一定下降。經(jīng)過二十多次對MGG 06742和MGG 09369基因敲除的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),分別獲得五百多個(gè)和兩百多個(gè)轉(zhuǎn)化子,但未能鑒定到這兩個(gè)基因的敲除突變體,因此,初步判斷它們可能是稻瘟病菌生存不可缺少的基因。4.稻瘟病菌MoSoml互作蛋白的初步篩選。利用親和純化的方法獲得可能與MoSoml互作的混合蛋白樣品,LC/MS分析結(jié)果顯示候選互作蛋白有1101個(gè),根據(jù)功能可將其歸為23個(gè)不同類別,其中與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)的有37個(gè)。進(jìn)一步分析顯示,這37個(gè)候選蛋白中包含MAPK信號途徑中的組件如Pmk1 (MGG_09565)、Mkk2 (MGG_06482)、Ras1 (MGG_06154)等。后續(xù)有待用酵母雙雜交(Y2H)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證這些候選蛋白是否能在體外條件下與MoSoml互作,進(jìn)而探究稻瘟病菌cAMP-PKA途徑和MAPK途徑下游的cross talk。
【關(guān)鍵詞】：稻瘟病菌 MoSom1 剪切異構(gòu)體 磷酸化位點(diǎn) LisH模體
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S435.111.41
【目錄】：

• 致謝8-9
• 摘要9-11
• Abstract11-16
• 第一章 文章綜述16-30
• 1 稻瘟病與稻瘟病菌16-19
• 1.1 稻瘟病16-17
• 1.2 稻瘟病菌的侵染循環(huán)17-19
• 2 cAMP-PKA信號途徑19-24
• 2.1 酵母cAMP-PKA信號途徑研究進(jìn)展20-22
• 2.2 稻瘟病菌cAMP-PKA信號途徑研究進(jìn)展22-24
• 3 轉(zhuǎn)錄因子Flo8和LisH模體的研究進(jìn)展24-27
• 3.1 Flo8概況24-26
• 3.2 LisH模體概況26-27
• 4 本研究的目的與意義27-30
• 第二章 材料與方法30-50
• 1 實(shí)驗(yàn)材料30-34
• 1.1 供試菌株30
• 1.2 供試質(zhì)粒載體30
• 1.3 供試植物30
• 1.4 供試試劑30-31
• 1.5 供試抗生素31
• 1.6 培養(yǎng)基及配方31-34
• 2 實(shí)驗(yàn)方法34-50
• 2.1 常規(guī)PCR反應(yīng)34-35
• 2.2 DNA操作35-39
• 2.2.1 大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取35-36
• 2.2.2 快速小量抽提稻瘟病菌基因組DNA36
• 2.2.3 CTAB法大量抽提稻瘟病菌基因組DNA36-37
• 2.2.4 DNA的酶切37
• 2.2.5 DNA的瓊脂糖凝膠電泳37-38
• 2.2.6 DNA的凝膠回收38
• 2.2.7 片段DNA連接載體反應(yīng)38-39
• 2.2.8 質(zhì)粒DNA的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化39
• 2.3 RNA操作39-40
• 2.3.1 稻瘟病菌總RNA的提取39-40
• 2.3.2 cDNA的合成40
• 2.4 稻瘟病菌基因的敲除及互補(bǔ)40-43
• 2.4.1 敲除策略及敲除載體的構(gòu)建40-41
• 2.4.2 互補(bǔ)策略及互補(bǔ)載體的構(gòu)建41-42
• 2.4.3 稻瘟病菌原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化42-43
• 2.5 稻瘟病菌基因組的Southern Blot(地高辛標(biāo)記法)43-46
• 2.5.1 基因組的酶切、電泳及變性43
• 2.5.2 轉(zhuǎn)膜43-44
• 2.5.3 DIG標(biāo)記DNA探針及雜交液的準(zhǔn)備44
• 2.5.4 預(yù)雜交44-45
• 2.5.5 雜交45
• 2.5.6 印記膜的洗滌45
• 2.5.7 免疫顯色45-46
• 2.6 蛋白操作46-50
• 2.6.1 稻瘟病菌總蛋白的提取46
• 2.6.2 Western Blot46-48
• 2.6.3 目標(biāo)蛋白的親和純化48-50
• 第三章 結(jié)果與分析50-63
• 1 MoSom1不同剪切異構(gòu)體的功能分析50-53
• 2 MoSom1的PKA磷酸化位點(diǎn)功能分析53-58
• 2.1 MoSom1 PKA磷酸化位點(diǎn)的生物信息學(xué)初步預(yù)測53-54
• 2.2 預(yù)測位點(diǎn)缺失載體的構(gòu)建54
• 2.3 點(diǎn)缺失轉(zhuǎn)化子的獲得及表型分析54-56
• 2.4 T151、S227和S228丙氨酸和谷氨酸替換載體的構(gòu)建56
• 2.5 MoSOM1~(T151A/E)、MoSOM1~(S227A/E)和MoSOM1~(S228A/E)替換轉(zhuǎn)化子的獲得及表型分析56-58
• 3 稻瘟病菌含LisH模體蛋白編碼基因的敲除58-61
• 3.1 稻瘟病菌中含LisH模體蛋白編碼基因的生物信息學(xué)分析58-59
• 3.2 MGG_01665、MGG_04137和MGG_00753的敲除59
• 3.3 MGG_06742和MGG_09369的敲除59-61
• 4 MoSom1互作蛋白的初步篩選61-63
• 第四章 全文總結(jié)與討論63-66
• 參考文獻(xiàn)66-72
• 附錄172-75
• 附錄275

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