本文關(guān)鍵詞：蛋雞感染基因Ⅶd亞型NDV后輸卵管組織中病毒分布和Toll樣受體表達(dá)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：新城疫(Newcastle disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)引起的禽類的一種重要傳染病。新城疫不僅能引起感染雞的死亡,還導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量下降,畸形蛋、軟殼蛋及沙殼蛋增多,表明雞生殖道也是NDV的靶組織。流行病學(xué)的研究表明,在過(guò)去十年里,基因Ⅶ型新城疫病毒是包括中國(guó)在內(nèi)亞洲雞和鵝中暴發(fā)的主要基因型。近些年,大部分研究致力于基因ⅦNDV對(duì)免疫器官的損傷,但有關(guān)NDV感染蛋雞輸卵管病理?yè)p傷的研究很少。研究輸卵管的局部免疫,尤其是天然免疫在基因Ⅶd亞型NDV感染后的作用,對(duì)于NDV感染導(dǎo)致蛋雞輸卵管功能障礙的致病機(jī)制研究至關(guān)重要。本研究采用滴鼻和點(diǎn)眼的方法,用基因Ⅶd亞型NDV人工感染40周齡蛋雞,觀察蛋雞的臨床癥狀及輸卵管組織損傷;通過(guò)構(gòu)建熒光定量PCR方法,檢測(cè)不同感染時(shí)間輸卵管各部分的病毒復(fù)制水平;HN蛋白免疫熒光染色觀察病毒浸染輸卵管細(xì)胞的類型;Real-time RT-PCR檢測(cè)模式識(shí)別受體Toll樣受體和MDA5的表達(dá)情況;以及不同感染時(shí)間膨大部CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。試驗(yàn)結(jié)果如下:1.基因Ⅶd亞型NDV人工感染非免健康蛋雞。感染后分別在第1 d、3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、15 d頸部放血處死5只蛋雞。按輸卵管的傘部、膨大部、峽部、子宮部和陰道部取材。建立了NDV M基因real-time RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線,相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9979。參照建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,real-time RT-PCR檢測(cè)了輸卵管不同部位的病毒載量,發(fā)現(xiàn)輸卵管5個(gè)部位均能檢測(cè)到NDV,且在第5 d病毒載量最高,膨大部病毒載量達(dá)8918.6 copies/μL,子宮部達(dá)2934.6 copies/μL。NDV HN蛋白染色在感染雞的輸卵管5個(gè)部位都為陽(yáng)性,且固有層細(xì)胞和黏膜層細(xì)胞均受到病毒的侵染。2.HE染色發(fā)現(xiàn)蛋雞感染基因Ⅶd亞型NDV后,輸卵管組織膨大部和子宮部出現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化。膨大部的腺體出現(xiàn)充血出血,甚至腺體開始溶解,黏膜層開始變薄。子宮部的腔上皮管狀腺水腫,固有層淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死,脫落。用熒光定量方法檢測(cè)NDV感染蛋雞后輸卵管膨大部和子宮部的天然免疫模式識(shí)別受TLR3/7/21和MDA5基因mRNA在感染后不同時(shí)間的表達(dá)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在膨大部和子宮部都呈現(xiàn)出上調(diào)的趨勢(shì),其中膨大部TLR3/7/21 mRNA表達(dá)在蛋雞感染后第5 d達(dá)到峰值,升高的倍數(shù)分別達(dá)42.6,98.9和27.1倍。3.免疫熒光染色觀察CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞在輸卵管膨大部浸潤(rùn)情況。結(jié)果表明,NDV感染組CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞在膨大部明顯多于健康對(duì)照組,CD3+CD8α+和CD3+CD4+淋巴細(xì)胞在感染第1 d后開始增多,分別在感染后第3 d和第5 d達(dá)到最多。CD3+CD4+和CD3+CD8α+淋巴細(xì)胞主要分布在膨大部的固有層和黏膜上皮。CD4+主要分布在固有層,CD8α+主要分布在黏膜上皮,而且CD8α+比CD4+更能滲透到黏膜上皮的底部。綜上所述,蛋雞感染基因Ⅶd亞型NDV后,病毒能夠侵染輸卵管不同部位復(fù)制,引起輸卵管發(fā)生嚴(yán)重病理?yè)p傷。本研究結(jié)果為揭示NDV感染導(dǎo)致產(chǎn)蛋雞輸卵管功能障礙和產(chǎn)蛋下降提供了一定的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：基因Ⅶd亞型NDV 輸卵管組織 Toll樣受體 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn) 產(chǎn)蛋雞
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S858.31
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-12
• 文獻(xiàn)綜述12-21
• 第一章 家禽對(duì)新城疫病毒的免疫反應(yīng)研究進(jìn)展12-21
• 1.1 新城疫病毒的概述12
• 1.2 NDV的一般生物學(xué)特性12-14
• 1.2.1 NDV的分類12-13
• 1.2.2 理化特性13
• 1.2.3 血凝活性和神經(jīng)氨酸酶活性13
• 1.2.4 NDV基因組結(jié)構(gòu)及主要編碼蛋白13-14
• 1.3 NDV的致病機(jī)理14
• 1.3.1 致病性的分子基礎(chǔ)14
• 1.3.2 強(qiáng)毒株的出現(xiàn)14
• 1.4 家禽對(duì)NDV免疫反應(yīng)14-19
• 1.4.1 天然免疫反應(yīng)15-17
• 1.4.1.1 模式識(shí)別受體15-16
• 1.4.1.2 天然免疫因子16-17
• 1.4.2 體液免疫17-18
• 1.4.3 細(xì)胞免疫18-19
• 1.5 雞輸卵管結(jié)構(gòu)與功能19-20
• 1.6 本研究目的意義20-21
• 試驗(yàn)研究21-41
• 第二章 蛋雞感染基因VIId NDV后輸卵管組織中病毒載量及分布研究21-32
• 2.1 材料21-22
• 2.1.1 毒株21
• 2.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物21
• 2.1.3 主要試劑21-22
• 2.1.4 主要儀器22
• 2.2 方法22-26
• 2.2.1 病毒增殖22-23
• 2.2.2 測(cè)定病毒的EID_(50)23
• 2.2.3 蛋雞人工感染基因VIId NDV及臨床癥狀觀察23
• 2.2.4 NDV M基因real-time RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立23-25
• 2.2.4.1 引物的設(shè)計(jì)及合成23
• 2.2.4.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的制備23-25
• 2.2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立25
• 2.2.5 基因VIId NDV感染蛋雞輸卵管組織中不同部位病毒載量的檢測(cè)25-26
• 2.2.5.1 輸卵管部位總RNA的提取25
• 2.2.5.2 cDNA的合成25
• 2.2.5.3 Real-time RT-PCR25
• 2.2.5.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析25-26
• 2.2.6 免疫熒光染色檢測(cè)NDV感染蛋雞輸卵管組織中HN蛋白26
• 2.2.6.1 石蠟切片的制作26
• 2.2.6.2 HN蛋白的熒光染色26
• 2.3 結(jié)果26-30
• 2.3.1 基因VIId NDV感染蛋雞臨床癥狀及病變觀察26-27
• 2.3.2 NDV M基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立27-29
• 2.3.2.1 基因VIId NDV M基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果27
• 2.3.2.2 基因VIId型NDV M基因的克隆27-28
• 2.3.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立28-29
• 2.3.3 蛋雞輸卵管不同部位中NDV病毒載量的測(cè)定29
• 2.3.4 NDV病毒HN蛋白在輸卵管5個(gè)部位的分布情況29-30
• 2.4 討論30-31
• 2.5 小結(jié)31-32
• 第三章 蛋雞感染基因VIId NDV后輸卵管組織中Toll樣受體表達(dá)及炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)研究32-41
• 3.1 材料32-33
• 3.1.1 毒株和試驗(yàn)動(dòng)物32
• 3.1.2 主要試劑32-33
• 3.2 方法33-34
• 3.2.1 NDV感染蛋雞輸卵管膨大部和子宮部病理組織學(xué)檢測(cè)33
• 3.2.2 Real-time RT-PCR檢測(cè)Toll樣受體及MDA5基因的表達(dá)33
• 3.2.2.1 Real-time RT-PCR33
• 3.2.2.2 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析33
• 3.2.3 直接免疫熒光檢測(cè)CD3CD4和CD3CD8淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)33-34
• 3.2.3.1 結(jié)果的判定34
• 3.3 結(jié)果34-39
• 3.3.1 感染蛋雞輸卵管膨大部和子宮部病變情況34-35
• 3.3.2 Toll樣受體和MDA5基因在輸卵管膨大部和子宮部表達(dá)變化35-36
• 3.3.3 CD~(3+)CD~(4+)和CD~(3+)CD8α~+淋巴細(xì)胞在NDV感染雞輸卵管膨大部的分布36-39
• 3.4 討論39-40
• 3.5 小結(jié)40-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-48
• 附錄48-51
• 縮略詞表51-52
• 致謝52-53
• 作者簡(jiǎn)介53

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本文編號(hào)：306636