目的:構(gòu)建KM小鼠HBx（Hepatitis B virus X）表達模型,探討HBx對正常免疫功能小鼠肝臟細胞凋亡和周期的影響及其機制。方法:觀察肝前體細胞株（hepatic progenitor cells,HPCs）中慢病毒的轉(zhuǎn)染情況,qRT-PCR和Western blotting方法檢測HBx在肝前體細胞中的表達;將表達HBx的肝前體細胞經(jīng)肝門靜脈注射到KM小鼠體內(nèi)建立動物模型,于手術(shù)后60天、90天和120天觀察小鼠肝臟組織中EGFP的表達,使用qRT-PCR、Western blotting和免疫組化的方法檢測小鼠肝臟組織中HBx的表達;檢測小鼠肝臟細胞凋亡和周期相關(guān)因子以及Akt/mTOR信號通路因子的mRNA和蛋白表達水平;采用TUNEL-FITC/DAPI方法檢測小鼠肝臟細胞的凋亡率。結(jié)果:HBx-EGFP-14-19組小鼠肝臟細胞的凋亡率顯著降低,促凋亡因子caspase-9和Bad的mRNA和蛋白表達均下調(diào),而抗凋亡因子Bcl-xl的mRNA和蛋白表達上調(diào);CDK2、cyclinD1和cyclinE的mRNA表達水平較對照組上調(diào),CDK2、cyclinD1、cy... 

【文章來源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

肝前體細胞株中HBx的表達A：肝前體細胞株EGFP的表達

取小鼠肝臟組織冰凍切片：EGFP-14-19 60 天、EGFP-14-19 90 天、EGFP-14-19120 天、HBx-EGFP-14-19 60 天、HBx-EGFP-14-19 90 天和 HBx-EGFP-14-19 120天。熒光顯微鏡觀察并成像，結(jié)果顯示，小鼠肝臟組織切片均有熒光表達(圖 1.2)，說明 HBx 蛋白在肝臟中穩(wěn)定表達。采用 qRT-PCR 和 Western blotting 檢測 5 組肝臟組織 HBx 的表達情況。結(jié)果表明，與 EGFP-14-19 組和生理鹽水組小鼠肝臟組織相比，HBx-EGFP-14-19 組小鼠肝臟組織有 HBx 表達(圖 1.3A，B)。采用免疫組化法檢測三組肝臟組織中 HBx 蛋白的表達，結(jié)果顯示 HBx-EGFP-14-19 組小鼠肝臟組織有 HBx 的陽性染色，且細胞質(zhì)內(nèi)及細胞膜中均能觀察到棕黃色染色，而生理鹽水組與 EGFP-14-19 組未見陽性染色，表明 HBx 在小鼠肝臟中成功表達(圖 1.3C)。以上結(jié)果表明穩(wěn)定表達 HBx 的小鼠模型構(gòu)建成功，為研究 HBx 在體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。

圖 1.3 小鼠肝臟組織中 HBx 的表達A：Western blotting 法檢測小鼠肝臟細胞中 HBx 蛋白的表達。B：qRT-PCR 法檢測小鼠肝臟細胞中 HBx mRNA 的表達。C：免疫組化法檢測小鼠肝臟組織中 HBx 蛋白表達（200×）。**：P<0.01，與生理鹽水組、EGFP-14-19 組比較。（I:生理鹽水組；II:EGFP-14-19 組；III:HBx-EGFP-14-19 60 天組；IV: HBx-EGFP-14-19 90 天組；V:HBx-EGFP-14-19 120 天組）Fig. 1.3 Expression of HBx in mouse liver tissuesA: The protein expression of HBx in mouse liver cells was detected by Western blotting. B: ThemRNA expression of HBx in mouse liver cells was detected by qRT-PCR. C: The proteinexpression of HBx in mouse liver tissues was detected by immunohistochemistry (200×).**:P<0.01, compared with normal saline and EGFP-14-19 group. (I: normal saline group; II:EGFP-14-19 group; III: HBx-EGFP-14-19 60 day group; IV: HBx-EGFP-14-19 90 day group;V: HBx-EGFP-14-19 120 day group)4 討論

【參考文獻】：
期刊論文
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