發(fā)布時(shí)間：2021-03-04 09:35

　　目的:構(gòu)建KM小鼠HBx（Hepatitis B virus X）表達(dá)模型,探討HBx對(duì)正常免疫功能小鼠肝臟細(xì)胞凋亡和周期的影響及其機(jī)制。方法:觀察肝前體細(xì)胞株（hepatic progenitor cells,HPCs）中慢病毒的轉(zhuǎn)染情況,qRT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)HBx在肝前體細(xì)胞中的表達(dá);將表達(dá)HBx的肝前體細(xì)胞經(jīng)肝門靜脈注射到KM小鼠體內(nèi)建立動(dòng)物模型,于手術(shù)后60天、90天和120天觀察小鼠肝臟組織中EGFP的表達(dá),使用qRT-PCR、Western blotting和免疫組化的方法檢測(cè)小鼠肝臟組織中HBx的表達(dá);檢測(cè)小鼠肝臟細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)因子以及Akt/mTOR信號(hào)通路因子的mRNA和蛋白表達(dá)水平;采用TUNEL-FITC/DAPI方法檢測(cè)小鼠肝臟細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果:HBx-EGFP-14-19組小鼠肝臟細(xì)胞的凋亡率顯著降低,促凋亡因子caspase-9和Bad的mRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào),而抗凋亡因子Bcl-xl的mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào);CDK2、cyclinD1和cyclinE的mRNA表達(dá)水平較對(duì)照組上調(diào),CDK2、cyclinD1、cy... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

【文章頁(yè)數(shù)】：65 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

肝前體細(xì)胞株中HBx的表達(dá)A：肝前體細(xì)胞株EGFP的表達(dá)

取小鼠肝臟組織冰凍切片：EGFP-14-19 60 天、EGFP-14-19 90 天、EGFP-14-19120 天、HBx-EGFP-14-19 60 天、HBx-EGFP-14-19 90 天和 HBx-EGFP-14-19 120天。熒光顯微鏡觀察并成像，結(jié)果顯示，小鼠肝臟組織切片均有熒光表達(dá)(圖 1.2)，說(shuō)明 HBx 蛋白在肝臟中穩(wěn)定表達(dá)。采用 qRT-PCR 和 Western blotting 檢測(cè) 5 組肝臟組織 HBx 的表達(dá)情況。結(jié)果表明，與 EGFP-14-19 組和生理鹽水組小鼠肝臟組織相比，HBx-EGFP-14-19 組小鼠肝臟組織有 HBx 表達(dá)(圖 1.3A，B)。采用免疫組化法檢測(cè)三組肝臟組織中 HBx 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示 HBx-EGFP-14-19 組小鼠肝臟組織有 HBx 的陽(yáng)性染色，且細(xì)胞質(zhì)內(nèi)及細(xì)胞膜中均能觀察到棕黃色染色，而生理鹽水組與 EGFP-14-19 組未見(jiàn)陽(yáng)性染色，表明 HBx 在小鼠肝臟中成功表達(dá)(圖 1.3C)。以上結(jié)果表明穩(wěn)定表達(dá) HBx 的小鼠模型構(gòu)建成功，為研究 HBx 在體內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ)。

圖 1.3 小鼠肝臟組織中 HBx 的表達(dá)A：Western blotting 法檢測(cè)小鼠肝臟細(xì)胞中 HBx 蛋白的表達(dá)。B：qRT-PCR 法檢測(cè)小鼠肝臟細(xì)胞中 HBx mRNA 的表達(dá)。C：免疫組化法檢測(cè)小鼠肝臟組織中 HBx 蛋白表達(dá)（200×）。**：P<0.01，與生理鹽水組、EGFP-14-19 組比較。（I:生理鹽水組；II:EGFP-14-19 組；III:HBx-EGFP-14-19 60 天組；IV: HBx-EGFP-14-19 90 天組；V:HBx-EGFP-14-19 120 天組）Fig. 1.3 Expression of HBx in mouse liver tissuesA: The protein expression of HBx in mouse liver cells was detected by Western blotting. B: ThemRNA expression of HBx in mouse liver cells was detected by qRT-PCR. C: The proteinexpression of HBx in mouse liver tissues was detected by immunohistochemistry (200×).**:P<0.01, compared with normal saline and EGFP-14-19 group. (I: normal saline group; II:EGFP-14-19 group; III: HBx-EGFP-14-19 60 day group; IV: HBx-EGFP-14-19 90 day group;V: HBx-EGFP-14-19 120 day group)4 討論

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]HBx基因抑制肝前體細(xì)胞凋亡與分化的小鼠體內(nèi)研究[J]. 霍本念,劉潔,王薛,張婷,劉夢(mèng)楠,馮濤.  第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(05)
[2]穩(wěn)定表達(dá)HBx的肝前體細(xì)胞株的構(gòu)建及其對(duì)增殖的影響[J]. 蘆永良,申利紅,李紅麗,胡代曦,張錫峰,胡斌,馮濤,黃佳祎.  細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志. 2013(03)
[3]乙肝病毒X蛋白對(duì)肝前體細(xì)胞分化的影響[J]. 白光文,申利紅,盧永良,李紅麗,馮濤,黃佳祎.  重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 2012(10)
[4]HBx activates FasL and mediates HepG2 cell apoptosis through MLK3-MKK7-JNKs signal module[J]. Ren-Xian Tang,Fan-Yun Kong,Bao-Feng Fan,Xiao-Mei Liu,Hong-Juan You,Peng Zhang,Kui-Yang Zheng ,Department of Pathogenic Biology and Lab of Infection and Immunology,Xuzhou Medical College,Xuzhou 221002,Jiangsu Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2012(13)



本文編號(hào)：3062984