發(fā)布時間：2021-03-03 05:18

　　目的:為了檢測CRISPR/Cas9系統(tǒng)的潛在脫靶效應(yīng),分別利用野生型Cas9和切口酶Cas9-D10A構(gòu)建了RNA甲基轉(zhuǎn)移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并對兩種策略得到的F0小鼠進行脫靶分析,以比較兩種敲除策略的特異性。方法:針對Nsun5基因第3外顯子,設(shè)計1對sgRNA,將野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9-D10A mRNA分別同這對sgRNA混合后注入小鼠一細胞期受精卵中,實現(xiàn)靶基因敲除,比較兩種Cas9得到的F0代敲除小鼠的脫靶效應(yīng)。結(jié)果:利用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,對兩種Cas9得到的F0代突變小鼠進行潛在脫靶位點分析,均未檢測到脫靶位點的存在。結(jié)論:兩種策略都成功構(gòu)建了不含脫靶位點的Nsun5基因敲除小鼠模型,為進一步研究Nsun5的生物學功能打下基礎(chǔ)。 

【文章來源】：南京醫(yī)科大學學報(自然科學版). 2020,40(09)北大核心

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【部分圖文】：

CRISPR/Cas9介導小鼠Nsun5基因敲除鑒定

本研究利用Cas9/sgRNA和Cas9-D10A/sgRNA對小鼠RNA甲基化相關(guān)基因Nsun5進行了敲除，檢測了每個sgRNA潛在的脫靶位點，但并沒有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)，為研究Nsun5的生物學功能提供了可靠的敲除小鼠模型。本研究挑選了10個最容易發(fā)生脫靶效應(yīng)的位點進行檢測，在其他未檢測的位點，可能會存在脫靶效應(yīng)；由于T7EN1酶切檢測方法存在檢測極限（小于1%的突變檢測不到），低突變的脫靶位點可能會被遺漏；另外，首建小鼠易存在嵌合效應(yīng)（DNA雙鏈斷裂發(fā)生在一細胞期之后），本研究只檢測了腳趾基因組DNA的脫靶效應(yīng)，不能代表其他器官，特別是生殖細胞中的脫靶情況。如利用全基因測序和靶向深度測序?qū)κ捉ㄊ蟮暮蟠M行測序，能更精確地檢測這兩種策略的脫靶效應(yīng)。本課題組的前期研究顯示，利用Cas9和雙sgRNA敲除小鼠Ar基因時，在突變小鼠尾巴基因組中可以檢測到1個脫靶位點[13]，但在Cas9-D10A和雙sgRNA策略構(gòu)建的小鼠中檢測不到這個脫靶位點，說明脫靶的發(fā)生和序列特異性以及目標序列上下游的環(huán)境有一定關(guān)系。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷完善，在科學研究和臨床應(yīng)用中發(fā)揮了舉足輕重的作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅可以對不同物種進行基因敲除[14-15]，還可以利用其造成的DNA雙鏈斷裂，同時提供供體DNA，在基因組中實現(xiàn)定點插入突變[16]。在基因調(diào)控上，利用催化區(qū)域失活的Cas9蛋白（dCas9，兩個內(nèi)切酶活性中心都被突變，失去切割活性，但是其在sgRNA的指導下仍能夠和靶序列結(jié)合），成功對基因表達進行調(diào)控[17-18]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可對染色體組蛋白進行修飾[19-20]，用于文庫篩選[21-22]等。CRISPR-Cas工具極大地加快了研究進程，也為疾病診斷和治療帶來了新方法，值得進一步探索。

【參考文獻】：
期刊論文
[1]m6A識別蛋白Ythdf3在精子發(fā)生中的作用研究[J]. 宋小玲,劉媛媛,王仿竹,沈彬.  南京醫(yī)科大學學報(自然科學版). 2019(06)
[2]m6A識別蛋白Ythdf1在精子發(fā)生中的作用研究[J]. 劉媛媛,宋小玲,王仿竹,齊美杰,沈彬.  南京醫(yī)科大學學報(自然科學版). 2019(02)



本文編號：3060687