目的:為了檢測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)的潛在脫靶效應(yīng),分別利用野生型Cas9和切口酶Cas9-D10A構(gòu)建了RNA甲基轉(zhuǎn)移酶Nsun5基因敲除小鼠模型,并對(duì)兩種策略得到的F0小鼠進(jìn)行脫靶分析,以比較兩種敲除策略的特異性。方法:針對(duì)Nsun5基因第3外顯子,設(shè)計(jì)1對(duì)sgRNA,將野生型Cas9 mRNA和切口酶Cas9-D10A mRNA分別同這對(duì)sgRNA混合后注入小鼠一細(xì)胞期受精卵中,實(shí)現(xiàn)靶基因敲除,比較兩種Cas9得到的F0代敲除小鼠的脫靶效應(yīng)。結(jié)果:利用CRISPR/Cas9和Cas9-D10A成功建立Nsun5基因敲除小鼠模型,對(duì)兩種Cas9得到的F0代突變小鼠進(jìn)行潛在脫靶位點(diǎn)分析,均未檢測(cè)到脫靶位點(diǎn)的存在。結(jié)論:兩種策略都成功構(gòu)建了不含脫靶位點(diǎn)的Nsun5基因敲除小鼠模型,為進(jìn)一步研究Nsun5的生物學(xué)功能打下基礎(chǔ)。 

【文章來(lái)源】：南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2020,40(09)北大核心

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CRISPR/Cas9介導(dǎo)小鼠Nsun5基因敲除鑒定

本研究利用Cas9/sgRNA和Cas9-D10A/sgRNA對(duì)小鼠RNA甲基化相關(guān)基因Nsun5進(jìn)行了敲除，檢測(cè)了每個(gè)sgRNA潛在的脫靶位點(diǎn)，但并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)，為研究Nsun5的生物學(xué)功能提供了可靠的敲除小鼠模型。本研究挑選了10個(gè)最容易發(fā)生脫靶效應(yīng)的位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，在其他未檢測(cè)的位點(diǎn)，可能會(huì)存在脫靶效應(yīng)；由于T7EN1酶切檢測(cè)方法存在檢測(cè)極限（小于1%的突變檢測(cè)不到），低突變的脫靶位點(diǎn)可能會(huì)被遺漏；另外，首建小鼠易存在嵌合效應(yīng)（DNA雙鏈斷裂發(fā)生在一細(xì)胞期之后），本研究只檢測(cè)了腳趾基因組DNA的脫靶效應(yīng)，不能代表其他器官，特別是生殖細(xì)胞中的脫靶情況。如利用全基因測(cè)序和靶向深度測(cè)序?qū)κ捉ㄊ蟮暮蟠M(jìn)行測(cè)序，能更精確地檢測(cè)這兩種策略的脫靶效應(yīng)。本課題組的前期研究顯示，利用Cas9和雙sgRNA敲除小鼠Ar基因時(shí)，在突變小鼠尾巴基因組中可以檢測(cè)到1個(gè)脫靶位點(diǎn)[13]，但在Cas9-D10A和雙sgRNA策略構(gòu)建的小鼠中檢測(cè)不到這個(gè)脫靶位點(diǎn)，說(shuō)明脫靶的發(fā)生和序列特異性以及目標(biāo)序列上下游的環(huán)境有一定關(guān)系。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷完善，在科學(xué)研究和臨床應(yīng)用中發(fā)揮了舉足輕重的作用。CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅可以對(duì)不同物種進(jìn)行基因敲除[14-15]，還可以利用其造成的DNA雙鏈斷裂，同時(shí)提供供體DNA，在基因組中實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)插入突變[16]。在基因調(diào)控上，利用催化區(qū)域失活的Cas9蛋白（dCas9，兩個(gè)內(nèi)切酶活性中心都被突變，失去切割活性，但是其在sgRNA的指導(dǎo)下仍能夠和靶序列結(jié)合），成功對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[17-18]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可對(duì)染色體組蛋白進(jìn)行修飾[19-20]，用于文庫(kù)篩選[21-22]等。CRISPR-Cas工具極大地加快了研究進(jìn)程，也為疾病診斷和治療帶來(lái)了新方法，值得進(jìn)一步探索。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]m6A識(shí)別蛋白Ythdf3在精子發(fā)生中的作用研究[J]. 宋小玲,劉媛媛,王仿竹,沈彬.  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019(06)
[2]m6A識(shí)別蛋白Ythdf1在精子發(fā)生中的作用研究[J]. 劉媛媛,宋小玲,王仿竹,齊美杰,沈彬.  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019(02)



本文編號(hào)：3060687