DGAT1酶（�；o酶A:二�；拾彼�-甘油�；D(zhuǎn)移酶）利用�；�-CoA底物催化sn-1,2-二酰基甘油在sn-3位的�；�,是控制脂肪細(xì)胞中甘油三酯合成速率的關(guān)鍵酶。甘油三酯是肌內(nèi)脂肪的主要成分,其含量的提高會促進(jìn)肌間脂肪的沉積,因此DGAT1可以作為改良家畜肉質(zhì)性狀的備選基因。CRISPR/Cas9技術(shù)可以高效的實(shí)現(xiàn)基因的敲除或敲入。本研究構(gòu)建了Rosa26位點(diǎn)定點(diǎn)整DGAT1基因的CRISPR/Cas9打靶載體,采用顯微注射法將載體注入小鼠受精卵原核中,生產(chǎn)DGAT1過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠。研究結(jié)果如下:1.載體的構(gòu)建本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)基因的定點(diǎn)敲入,首先構(gòu)建了sgRNA/Cas9載體以及DGAT1同源重組載體,經(jīng)過酶切、測序鑒定分析,證實(shí)兩種載體構(gòu)建成功。2.載體的功能驗(yàn)證利用電穿孔轉(zhuǎn)染方法將sgRNA/Cas9載體、DGAT1同源重組載體轉(zhuǎn)入C2C12細(xì)胞中,提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞基因組并利用PCR鑒定外源基因同源重組的情況,結(jié)果證明載體可以成功在預(yù)定位點(diǎn)敲入目的基因。3.轉(zhuǎn)基因小鼠的制備與鑒定通過原核注射法將sgRNA/Cas9質(zhì)粒、DGAT1整合載體共同注入小鼠... 

【文章來源】：內(nèi)蒙古大學(xué)內(nèi)蒙古自治區(qū) 211工程院校

【文章頁數(shù)】：63 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRSPR/Cas9質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖

圖 2.2 DGAT1-19T 雙酶切鑒定電泳圖M:200bpMarker 1：DGAT1-19T 載體Fig. 2.2 Identification of DGAT1-19T by double enzyme digestiM:200bpMarker 1:DGAT1-19T vector子的鑒定到小鼠 MCK 核心啟動子，其片段大小為 1357bp，將該上，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果與預(yù)期相符(圖 100%，核心啟動子獲取成功。

圖 2.3 MCK-19T 雙酶切鑒定電泳圖M:200bpMarker 1:MCK-19T 載體Fig. 2.3 Identification of MCK-19T by double enzyme digestiM:200bpMarker 1:MCK-19t vector鑒定到上游同源臂，得到預(yù)期為 996bp 大小的上游同源臂序入 pMD19-T 載體中，挑取菌液并提取質(zhì)粒然后進(jìn)行酶結(jié)果與正確序列進(jìn)行比對，一致性達(dá) 100%，說明上游

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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[2]CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在農(nóng)業(yè)動物中的應(yīng)用[J]. 幸宇云,楊強(qiáng),任軍.  遺傳. 2016(03)
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[4]陜北白絨山羊DGAT1基因外顯子14多態(tài)性及其與部分生長*和胴體性狀的關(guān)系[J]. 余剛,羅軍,劉俊霞,韓雪峰,繩賀軍,張麗娟,武會娟,曹艷紅.  西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版). 2008(05)

博士論文
[1]豬DGAT1基因肌肉超表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠及克隆豬的檢測驗(yàn)證[D]. 黎婷.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 2013



本文編號：3060620