醇脫氫酶（ADHs,E.C.1.1.1.1）屬于氧化還原酶,能以NAD（P）H為輔酶,催化醇與相應的醛、酮相互轉(zhuǎn)化。該酶在醇類代謝途徑中起重要作用,常具有高立體選擇性和廣泛底物譜,因而被普遍應用于醫(yī)藥研究、化工生產(chǎn)和食品領域。本論文對羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri DSM20016中的5種醇脫氫酶進行了克隆表達,并優(yōu)化了誘導條件,研究了酶學性質(zhì),為其影響奶酪芳香氣味的體內(nèi)驗證奠定了分子生物學基礎。主要研究結(jié)果如下:（1）本文成功克隆了 5個來自L.reutreri DSM20016的醇脫氫酶基因（adh-1、adh-2、adh-3、adh-4和adh-5）,分別連接到質(zhì)粒 pRSFDuet-1 上,并在Escheria coli BL21（DE3）中表達。5 種 ADHs 預測分子量分別為 37.6kDa、37.8 kDa、35.8 kDa、36.0kDa 和39.0 kDa,其保守結(jié)構(gòu)域分析顯示這5種ADHs屬于中鏈脫氫酶家族。經(jīng)過酶活驗證,發(fā)現(xiàn)5種ADHs對影響奶酪風味的庚醛均有一定活性。（2）本文優(yōu)化了醇脫氫酶重組菌的誘導條件,得到重組菌的最適誘導條件:誘... 

【文章來源】：江南大學江蘇省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

ADHs催化酮的不對稱還原反應

江南大學碩士學位論文18(e)圖3-1ADHs的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3-1ConserveddomainsofADHs注：ADH-1(a)，ADH-2(b)，ADH-3(c)，ADH-4(d)，ADH-5(e).3.1.2ADHs的分子克隆根據(jù)Primer5.0軟件設計的引物，對L.reuteriDSM20016中的ADHs基因進行PCR擴增，得到的PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證，如圖3-2所示，結(jié)果顯示克隆片段與預期基因片段大小符合。將PCR產(chǎn)物和pRSFDuet-1質(zhì)粒純化后，用SacI和BamHI在37°C酶切1h。酶切產(chǎn)物經(jīng)過純化后與pRSFDuet-1質(zhì)粒連接，16°C連接12h。隨后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)，涂布在LB抗性平板（Kanar）上進行過夜培養(yǎng)。挑取單菌落進行菌落PCR驗證，結(jié)果如圖3-3所示，可以看到5個ADHs均有陽性克攏驗證正確的轉(zhuǎn)化子接入液體LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，另外提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，用SacI和BamHI進行雙酶切驗證，結(jié)果顯示酶切后獲得基因片段約為1kb，與之前預測基因大小一致。為了進一步保證重組質(zhì)粒準確性，將經(jīng)過酶切驗證的轉(zhuǎn)化子進行序列測定，當測序拼接得到的序列與NCBI上獲得的一致，說明目的基因成功連接到pRSFDuet-1質(zhì)粒上。圖3-2目的基因的PCR產(chǎn)物Fig.3-2PCRproductsoftargetgenesM:DL2000DNAMarker;1:adh-1;2:adh-2;3:adh-3;4:adh-4;5:adh-5.

第三章結(jié)果與討論19圖3-3菌落PCR鑒定圖Fig.3-3VerificationofcolonyPCRM:DL2000DNAMarker;1-6為ADH-1；7-12為ADH-2；13-18為ADH-3；19-24為ADH-4；25-28為ADH-5。3.1.3ADHs的誘導表達重組大腸桿菌誘導表達后，8000×g離心5min，超聲波破碎后進一步得到上清液。通過蛋白電泳分析破碎后的上清液，發(fā)現(xiàn)有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶出現(xiàn)，如圖3-4。利用在線網(wǎng)站（http://web.expasy.org/protparam/）分析5個ADHs序列，得到相關分子大小的信息，五個ADHs均在350aa左右，符合一般鋅依賴型ADHs的特性（表3-1）。從圖3-4中可以看到目的蛋白表達水平各不相同，ADH-1、ADH-2和ADH-3的蛋白表達量較高。五個ADHs的分子量大小范圍均在35~39kDa，與報道的大多數(shù)鋅依賴型ADHs分子大小一致[70,71]。按照2.2.10中酶活檢測方法，測定重組蛋白的粗酶活性，結(jié)果表明5個ADHs均對庚醛有一定活性，ADH-1到ADH-5粗酶活依次為0.78U·mL-1、0.45U·mL-1、0.23U·mL-1、0.49U·mL-1、0.56U·mL-1。表3-1重組蛋白分子大小Table3-1Molecularofrecombinantprotein酶名稱氨基酸數(shù)目（aa）預測大�。╧Da）12%SDS-PAGE顯示大�。╧Da）ADH-135137.638ADH-233637.838ADH-334835.836ADH-434236.036ADH-536839.039

【參考文獻】：
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