醇脫氫酶（ADHs,E.C.1.1.1.1）屬于氧化還原酶,能以NAD（P）H為輔酶,催化醇與相應(yīng)的醛、酮相互轉(zhuǎn)化。該酶在醇類代謝途徑中起重要作用,常具有高立體選擇性和廣泛底物譜,因而被普遍應(yīng)用于醫(yī)藥研究、化工生產(chǎn)和食品領(lǐng)域。本論文對(duì)羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri DSM20016中的5種醇脫氫酶進(jìn)行了克隆表達(dá),并優(yōu)化了誘導(dǎo)條件,研究了酶學(xué)性質(zhì),為其影響奶酪芳香氣味的體內(nèi)驗(yàn)證奠定了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:（1）本文成功克隆了 5個(gè)來(lái)自L.reutreri DSM20016的醇脫氫酶基因（adh-1、adh-2、adh-3、adh-4和adh-5）,分別連接到質(zhì)粒 pRSFDuet-1 上,并在Escheria coli BL21（DE3）中表達(dá)。5 種 ADHs 預(yù)測(cè)分子量分別為 37.6kDa、37.8 kDa、35.8 kDa、36.0kDa 和39.0 kDa,其保守結(jié)構(gòu)域分析顯示這5種ADHs屬于中鏈脫氫酶家族。經(jīng)過(guò)酶活驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)5種ADHs對(duì)影響奶酪風(fēng)味的庚醛均有一定活性。（2）本文優(yōu)化了醇脫氫酶重組菌的誘導(dǎo)條件,得到重組菌的最適誘導(dǎo)條件:誘... 

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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ADHs催化酮的不對(duì)稱還原反應(yīng)

江南大學(xué)碩士學(xué)位論文18(e)圖3-1ADHs的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3-1ConserveddomainsofADHs注：ADH-1(a)，ADH-2(b)，ADH-3(c)，ADH-4(d)，ADH-5(e).3.1.2ADHs的分子克隆根據(jù)Primer5.0軟件設(shè)計(jì)的引物，對(duì)L.reuteriDSM20016中的ADHs基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物以1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，如圖3-2所示，結(jié)果顯示克隆片段與預(yù)期基因片段大小符合。將PCR產(chǎn)物和pRSFDuet-1質(zhì)粒純化后，用SacI和BamHI在37°C酶切1h。酶切產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后與pRSFDuet-1質(zhì)粒連接，16°C連接12h。隨后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)，涂布在LB抗性平板（Kanar）上進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖3-3所示，可以看到5個(gè)ADHs均有陽(yáng)性克攏驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子接入液體LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，另外提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，用SacI和BamHI進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，結(jié)果顯示酶切后獲得基因片段約為1kb，與之前預(yù)測(cè)基因大小一致。為了進(jìn)一步保證重組質(zhì)粒準(zhǔn)確性，將經(jīng)過(guò)酶切驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行序列測(cè)定，當(dāng)測(cè)序拼接得到的序列與NCBI上獲得的一致，說(shuō)明目的基因成功連接到pRSFDuet-1質(zhì)粒上。圖3-2目的基因的PCR產(chǎn)物Fig.3-2PCRproductsoftargetgenesM:DL2000DNAMarker;1:adh-1;2:adh-2;3:adh-3;4:adh-4;5:adh-5.

第三章結(jié)果與討論19圖3-3菌落PCR鑒定圖Fig.3-3VerificationofcolonyPCRM:DL2000DNAMarker;1-6為ADH-1；7-12為ADH-2；13-18為ADH-3；19-24為ADH-4；25-28為ADH-5。3.1.3ADHs的誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后，8000×g離心5min，超聲波破碎后進(jìn)一步得到上清液。通過(guò)蛋白電泳分析破碎后的上清液，發(fā)現(xiàn)有明顯的蛋白質(zhì)特征條帶出現(xiàn)，如圖3-4。利用在線網(wǎng)站（http://web.expasy.org/protparam/）分析5個(gè)ADHs序列，得到相關(guān)分子大小的信息，五個(gè)ADHs均在350aa左右，符合一般鋅依賴型ADHs的特性（表3-1）。從圖3-4中可以看到目的蛋白表達(dá)水平各不相同，ADH-1、ADH-2和ADH-3的蛋白表達(dá)量較高。五個(gè)ADHs的分子量大小范圍均在35~39kDa，與報(bào)道的大多數(shù)鋅依賴型ADHs分子大小一致[70,71]。按照2.2.10中酶活檢測(cè)方法，測(cè)定重組蛋白的粗酶活性，結(jié)果表明5個(gè)ADHs均對(duì)庚醛有一定活性，ADH-1到ADH-5粗酶活依次為0.78U·mL-1、0.45U·mL-1、0.23U·mL-1、0.49U·mL-1、0.56U·mL-1。表3-1重組蛋白分子大小Table3-1Molecularofrecombinantprotein酶名稱氨基酸數(shù)目（aa）預(yù)測(cè)大�。╧Da）12%SDS-PAGE顯示大�。╧Da）ADH-135137.638ADH-233637.838ADH-334835.836ADH-434236.036ADH-536839.039

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