以幾丁寡糖為代表的氨基寡糖具有豐富的生物活性,被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等多個領(lǐng)域。幾丁寡糖的傳統(tǒng)制造工藝主要借助于化學(xué)法、物理法和酶法降解幾丁質(zhì),但傳統(tǒng)制備方法存在以下瓶頸問題:（1）幾丁質(zhì)制備中脫鹽、脫蛋白環(huán)節(jié)需要引入大量強酸、強堿,后處理的環(huán)保壓力巨大;（2）水解法制備所得幾丁寡糖產(chǎn)物聚合度不可控、目前規(guī)�；a(chǎn)只能得到幾丁二糖。針對上述問題,本研究旨在發(fā)掘具有逆水解/轉(zhuǎn)糖苷潛力的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,以N-乙酰氨基葡萄糖為原料酶法逆向合成氨基寡糖,從而實現(xiàn)氨基寡糖的酶法綠色生物制造。首先,從基因組數(shù)據(jù)庫中篩選得到了 3個細(xì)菌（Bacillus amyloliquefaciens、Enterococcus faecalis和Lactobacillus casei）來源的潛在β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因BaNagase、EfNagase和LcNagase。通過序列進化分析確定BaNagase歸屬于糖苷水解酶3家族,EfNagase和LcNagase均屬于糖苷水解酶20家族。從微生物基因組DNA中克隆得到目的基因,并通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功異源重組表達(dá)、純化得到以上3種重組酶,... 

【文章來源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１．３幾丁質(zhì)在真菌和昆蟲中的合成途徑??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｃｈｉｔｉｎ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｆｕｎｇｉ?ａｎｄ?ｉｎｓｅｃｔｓ??（２）糖苷水解酶??

葡萄糖胺?ｅ°Ａ??圖１．３幾丁質(zhì)在真菌和昆蟲中的合成途徑??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｃｈｉｔｉｎ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｆｕｎｇｉ?ａｎｄ?ｉｎｓｅｃｔｓ??（２）糖苷水解酶??糖苷水解酶（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＧＨ）是一類催化水解糖鏈中特定糖苷鍵的糖苷??酶。ＣＡＺｙ數(shù)據(jù)庫（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）根據(jù)蛋白質(zhì)序列進化關(guān)系將其分為１００多個家??族。糖作水解酶根據(jù)催化機制的差別又可將其分為反轉(zhuǎn)型糖苷水解酶（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ?ｅｎｚｙｍｅｓ）??和保留型糖苷水解酶（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ?ｅｎｚｙｍｅｓ），具體作用方式如圖１．４所示。從保留型糖苷??７ｊＣ解酶的反應(yīng)機制中我們知道除了水解活性，其還具有轉(zhuǎn)糖甘（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，?ＴＧ）??潛力：在保留型糖苷水解酶的反應(yīng)中將形成糖基－酶中間體，若被另一糖分子攻擊，則??發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)。轉(zhuǎn)糖苷催化機制也可用于合成特定的低聚糖，目前已被應(yīng)用于不少低??聚糖的生產(chǎn)中，例如，低聚果糖以蔗糖作為底物，利用（３－Ｄ－呋喃果糖苷酶可大量得到；??低聚半乳糖也可以乳糖為底物，用Ｐ－半乳糖苷酶催化合成；類似地，在右旋糖酐、低聚??異麥芽糖和環(huán)糊精等的酶法合成都得到了應(yīng)用［４３￣４４］。類似的還有報道利用幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)??糖苷活性來合成幾丁寡糖。其中沙雷氏菌、米曲霉和煙曲霉等來源的ＧＨ１８家族幾丁質(zhì)??酶的轉(zhuǎn)糖苷活性的研究報道較多

被利用于寡糖合成的反應(yīng)中。糖苷合成酶一般利用氟代糖、硝基苯基糖苷作為糖基供體，??４－甲基傘形酮或硝基苯基修飾的糖苷做為受體。根據(jù)作用機制不同，糖苷合成酶也可分??為反轉(zhuǎn)型和保留型兩類（圖１．５）。而且由于糖苷合成酶喪失水解活性，合成的寡糖產(chǎn)物??不會被再次水解，則可使產(chǎn)率得到提升。??產(chǎn)Ｏ?〇?Ｌ??．ＵＨ?（）丄０?０Ｍ?（＼?１，０?°??一?ａ?ｅｔ?Ｖ．１Ｉ?ｌ〇Ｈ?■??ｋ?（ｙＨ?ｆ?Ｙ?ｆ??Ｊｎｚ?ｌ?ｌ?Ｅｔ１ｓ２?Ｅｎｘ??（ｂ）?Ｅｎｚ??°＾°?｛〇Ｈ?ＨｆＡ〇??（丨Ｘ＾〇Ｒ??Ｆ?Ｖ〇ｆ?Ｉ??Ｅｎｚ?Ｅｎｚ??圖１．５以ａ－氟代糖為糖基供體的反轉(zhuǎn)型糖苷合成酶（ａ）和保留型糖苷合成酶（ｂ）的作用機制…Ｉ??Ｆｉｇ?１．５?Ｆ＾ｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ?ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?（ａ）?ａｎｄ?ｒｅｔａｉｎｉｎｇ?ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?（ｂ）??ｗｉｔｈ?ａ－ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｆｌｕｏｒｉｄｅ?ａｓ?ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｄｏｎｏｒ??糖苷合成酶存在合成產(chǎn)率高、時間短、有嚴(yán)格的立體選擇性等優(yōu)點，是合成寡糖的??有效途徑之一。但其在合成幾丁寡糖的應(yīng)用上還面臨較多的困難：①Ｐ－Ｎ－乙酰氨基葡萄??糖苷酶類型的糖苷合成酶有待開發(fā)。目前只有一例來自凍土毛霉的ＧＨ８５家族內(nèi)切型??ＧｌｃＮＡｃａｓｅ的突變體Ｎ１７５Ｑ己見研究和報道［５５］，實現(xiàn)了水解活性的降低和轉(zhuǎn)糖苷效率??的提升。②選擇合適的非親核氨基酸類型。根據(jù)己有的研究發(fā)現(xiàn)，用不同種類的非親核??氨基酸來取代親核體的突變體

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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[2]幾種海洋寡糖免疫調(diào)控作用初探[D]. 劉美思.遼寧師范大學(xué) 2016
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本文編號：3059812