以幾丁寡糖為代表的氨基寡糖具有豐富的生物活性,被應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域。幾丁寡糖的傳統(tǒng)制造工藝主要借助于化學(xué)法、物理法和酶法降解幾丁質(zhì),但傳統(tǒng)制備方法存在以下瓶頸問(wèn)題:（1）幾丁質(zhì)制備中脫鹽、脫蛋白環(huán)節(jié)需要引入大量強(qiáng)酸、強(qiáng)堿,后處理的環(huán)保壓力巨大;（2）水解法制備所得幾丁寡糖產(chǎn)物聚合度不可控、目前規(guī)�；a(chǎn)只能得到幾丁二糖。針對(duì)上述問(wèn)題,本研究旨在發(fā)掘具有逆水解/轉(zhuǎn)糖苷潛力的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶,以N-乙酰氨基葡萄糖為原料酶法逆向合成氨基寡糖,從而實(shí)現(xiàn)氨基寡糖的酶法綠色生物制造。首先,從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到了 3個(gè)細(xì)菌（Bacillus amyloliquefaciens、Enterococcus faecalis和Lactobacillus casei）來(lái)源的潛在β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因BaNagase、EfNagase和LcNagase。通過(guò)序列進(jìn)化分析確定BaNagase歸屬于糖苷水解酶3家族,EfNagase和LcNagase均屬于糖苷水解酶20家族。從微生物基因組DNA中克隆得到目的基因,并通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功異源重組表達(dá)、純化得到以上3種重組酶,... 

【文章來(lái)源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

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圖１．３幾丁質(zhì)在真菌和昆蟲(chóng)中的合成途徑??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｃｈｉｔｉｎ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｆｕｎｇｉ?ａｎｄ?ｉｎｓｅｃｔｓ??（２）糖苷水解酶??

葡萄糖胺?ｅ°Ａ??圖１．３幾丁質(zhì)在真菌和昆蟲(chóng)中的合成途徑??Ｆｉｇ?１．３?Ｔｈｅ?ｃｈｉｔｉｎ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｐａｔｈｗａｙ?ｉｎ?ｆｕｎｇｉ?ａｎｄ?ｉｎｓｅｃｔｓ??（２）糖苷水解酶??糖苷水解酶（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ，ＧＨ）是一類(lèi)催化水解糖鏈中特定糖苷鍵的糖苷??酶。ＣＡＺｙ數(shù)據(jù)庫(kù)（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ）根據(jù)蛋白質(zhì)序列進(jìn)化關(guān)系將其分為１００多個(gè)家??族。糖作水解酶根據(jù)催化機(jī)制的差別又可將其分為反轉(zhuǎn)型糖苷水解酶（ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ?ｅｎｚｙｍｅｓ）??和保留型糖苷水解酶（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ?ｅｎｚｙｍｅｓ），具體作用方式如圖１．４所示。從保留型糖苷??７ｊＣ解酶的反應(yīng)機(jī)制中我們知道除了水解活性，其還具有轉(zhuǎn)糖甘（ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ，?ＴＧ）??潛力：在保留型糖苷水解酶的反應(yīng)中將形成糖基－酶中間體，若被另一糖分子攻擊，則??發(fā)生轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)。轉(zhuǎn)糖苷催化機(jī)制也可用于合成特定的低聚糖，目前已被應(yīng)用于不少低??聚糖的生產(chǎn)中，例如，低聚果糖以蔗糖作為底物，利用（３－Ｄ－呋喃果糖苷酶可大量得到；??低聚半乳糖也可以乳糖為底物，用Ｐ－半乳糖苷酶催化合成；類(lèi)似地，在右旋糖酐、低聚??異麥芽糖和環(huán)糊精等的酶法合成都得到了應(yīng)用［４３￣４４］。類(lèi)似的還有報(bào)道利用幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)??糖苷活性來(lái)合成幾丁寡糖。其中沙雷氏菌、米曲霉和煙曲霉等來(lái)源的ＧＨ１８家族幾丁質(zhì)??酶的轉(zhuǎn)糖苷活性的研究報(bào)道較多

被利用于寡糖合成的反應(yīng)中。糖苷合成酶一般利用氟代糖、硝基苯基糖苷作為糖基供體，??４－甲基傘形酮或硝基苯基修飾的糖苷做為受體。根據(jù)作用機(jī)制不同，糖苷合成酶也可分??為反轉(zhuǎn)型和保留型兩類(lèi)（圖１．５）。而且由于糖苷合成酶喪失水解活性，合成的寡糖產(chǎn)物??不會(huì)被再次水解，則可使產(chǎn)率得到提升。??產(chǎn)Ｏ?〇?Ｌ??．ＵＨ?（）丄０?０Ｍ?（＼?１，０?°??一?ａ?ｅｔ?Ｖ．１Ｉ?ｌ〇Ｈ?■??ｋ?（ｙＨ?ｆ?Ｙ?ｆ??Ｊｎｚ?ｌ?ｌ?Ｅｔ１ｓ２?Ｅｎｘ??（ｂ）?Ｅｎｚ??°＾°?｛〇Ｈ?ＨｆＡ〇??（丨Ｘ＾〇Ｒ??Ｆ?Ｖ〇ｆ?Ｉ??Ｅｎｚ?Ｅｎｚ??圖１．５以ａ－氟代糖為糖基供體的反轉(zhuǎn)型糖苷合成酶（ａ）和保留型糖苷合成酶（ｂ）的作用機(jī)制…Ｉ??Ｆｉｇ?１．５?Ｆ＾ｅａｃｔｉｏｎ?ｍｅｃｈａｎｉｓｍ?ｏｆ?ｉｎｖｅｒｔｉｎｇ?ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?（ａ）?ａｎｄ?ｒｅｔａｉｎｉｎｇ?ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ?ｓｙｎｔｈａｓｅ?（ｂ）??ｗｉｔｈ?ａ－ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｆｌｕｏｒｉｄｅ?ａｓ?ｇｌｙｃｏｓｙｌ?ｄｏｎｏｒ??糖苷合成酶存在合成產(chǎn)率高、時(shí)間短、有嚴(yán)格的立體選擇性等優(yōu)點(diǎn)，是合成寡糖的??有效途徑之一。但其在合成幾丁寡糖的應(yīng)用上還面臨較多的困難：①Ｐ－Ｎ－乙酰氨基葡萄??糖苷酶類(lèi)型的糖苷合成酶有待開(kāi)發(fā)。目前只有一例來(lái)自?xún)鐾撩沟模牵龋福导易鍍?nèi)切型??ＧｌｃＮＡｃａｓｅ的突變體Ｎ１７５Ｑ己見(jiàn)研究和報(bào)道［５５］，實(shí)現(xiàn)了水解活性的降低和轉(zhuǎn)糖苷效率??的提升。②選擇合適的非親核氨基酸類(lèi)型。根據(jù)己有的研究發(fā)現(xiàn)，用不同種類(lèi)的非親核??氨基酸來(lái)取代親核體的突變體

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]糖基轉(zhuǎn)移酶合成相關(guān)糖苷類(lèi)化合物研究進(jìn)展[J]. 趙千婧,程瑤,王佳,孫新曉,申曉林,袁其朋.  北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2018(05)
[2]里氏木霉幾丁質(zhì)酶表達(dá)及其水解產(chǎn)物組成與結(jié)構(gòu)分析[J]. 焦思明,程功,張毓宸,馮翠,任立世,李建軍,杜昱光.  中國(guó)生物工程雜志. 2018(10)
[3]Solitalea canadensis源β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因克隆、異源表達(dá)和酶學(xué)特性[J]. 王夢(mèng),危雙,王婷,Josef Voglmeir,劉麗.  微生物學(xué)報(bào). 2017(08)
[4]β-N-乙酰氨基己糖苷酶及其合成寡糖的研究進(jìn)展[J]. 陳曉迪,王鳳山,肖敏.  微生物學(xué)報(bào). 2017(08)
[5]β-葡萄糖苷酶合成龍膽二糖及產(chǎn)物分離[J]. 張林,王磊,吳廣興,勇強(qiáng),余世袁.  林業(yè)工程學(xué)報(bào). 2017(02)
[6]糖苷合成酶及應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 孟嵐,吳旭日,陳依軍.  廣西科學(xué). 2017(01)
[7]右旋糖苷蔗糖酶的研究進(jìn)展[J]. 韓瑨,吳正鈞,徐曉芬,吳江.  食品研究與開(kāi)發(fā). 2016(02)
[8]維氏氣單胞菌B565β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)[J]. 劉陽(yáng),楊雅麟,張宇婷,冉超,周志剛.  中國(guó)生物工程雜志. 2015(02)
[9]低聚半乳糖酶法合成條件的研究[J]. 陳真真,張濤,江波,繆銘,沐萬(wàn)孟.  食品與發(fā)酵工業(yè). 2012(10)
[10]糖鏈的化學(xué)合成[J]. 王玥,葉新山.  生命科學(xué). 2011(06)

碩士論文
[1]幾丁寡糖聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌A549細(xì)胞及其移植瘤的影響[D]. 劉星.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 2017
[2]幾種海洋寡糖免疫調(diào)控作用初探[D]. 劉美思.遼寧師范大學(xué) 2016
[3]家蠶幾丁質(zhì)酶與幾丁質(zhì)合成酶的基因表達(dá)與功能研究[D]. 孔令斐.蘇州大學(xué) 2010



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