天然免疫是天然免疫系統(tǒng)為自我成分與非自我成分的區(qū)分識別奠定了免疫應答與調控的基礎,干擾素調節(jié)因子3（Interferon regulatory factor3,IRF3）是干擾素調節(jié)因子家族的主要成員之一,也是天然免疫信號通路中重要的干擾素調節(jié)因子,當DNA病毒感染時可激活STING/TBK1/IRF3天然免疫信號通路,最終激活Ⅰ型干擾素（Type Ⅰ interferon,IFN）的表達。本試驗使用慢病毒介導的CRISPR/Cas9基因編輯技術構建IRF3基因穩(wěn)定敲除豬腎上皮PK15細胞系。構建pIRF3-sgRNA重組質粒與慢病毒包裝載體共轉染至HEK293T/17細胞,收獲慢病毒并感染PK15豬腎上皮細胞,經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得多克隆細胞系,T7酶切鑒定篩選基因編輯效率較高的多克隆細胞,然后通過有限稀釋法獲得PK15-IRF3-/-單克隆穩(wěn)定細胞系。為驗證IRF3基因穩(wěn)定敲除細胞系是否構建成功,首先使用熒光顯微鏡和流式細胞術觀察PRV-GFP病毒在感染PK15-WT以及PK1 5-IRF3-/-細胞后0h、6h、12h、24 h、36h、48 h病毒復制的差異,其次TCID50檢測P... 

【文章來源】：河南農業(yè)大學河南省

【文章頁數(shù)】：47 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

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的ｓｓＲＮＡ切割，從而使病毒起始階段受到影響導致??蛋廣１多肽鏈合成受附，從而能夠抑制病毒蛋白的轉錄合成。同時，ＲＮａｓｅ?Ｌ可切割部分自身??的ｍＲＮＡ也可以形成�。遥危�，這我小的ＲＮＡ激活ＲＩＧ－丨和ＭＤＡ－５等信號通路，從而誘導丨ＦＮ??生成及抑制病毒復制＠１。??ｎ?？?ｐ??ＯＭｇｏＡ?丄?Ａｃｔｉｖｅ??＾?ｓｒｒ?？??Ａｃｔｉｖｅ?｜??ＣＳＳＳ?（Ｗ）丄??個?〉Ｔｒｓｎｖｔｏｔｌｏｎ??ｒ—＞?ＩＲｆ?７?ｌｎｌ？ｒｆ＊ｒｏｎ??＿Ｊ???圖３?ＯＡＳ介導的ＲＮａｓｅ?Ｌ信號通路ｍ??Ｋｉｇ．３?ＯＡＳ?ｍｅｄｉａｔｅｄ?ＲＮａｓｅ?Ｌ?ｓｉｇｎａｌｉｎｇ?ｐａｔｈｗａｙ?１５５１??１．４．３．５丨ＳＧＩ?５信號通路??ＩＦＮｉ秀導產(chǎn)Ｕ「多類抗病得ａａ＇ｍ中ＩＳＧ就足較為？耍的類，其中丨ＳＧ１５足丨ＦＮ誘導能??夠的抑制病冉效成較為不＋＿Ｈ要作用的抗�。叩伴V？雖然在很多年前就Ｗ科學家克隆出丨ＳＧ１５??描Ｗ，其具Ａ抗病訴效應足近年來Ｉ被人們所認知，但是其抗病毒機制尚未研宂清楚。研究??農明：ＩＳＧ１５＂］？促進病毐介導的丨ＦＮ調節(jié)因子３激活，從而提高ＩＦＮ－Ｐ的釋放與其抗病毒效果??相反，磷酸＿２（：－０：丨：要利用調擰轉化牛長因子－Ｐ?（ＴＧＦ－｜３）活化和激酶磷酸化，而ＩＳＧ１５??可以和蛋丨１磷酸？２Ｃ－Ｐ結合特異性競爭結果，達到后負向調控該機制進而增強ＮＦ－ｋＢ信號傳??導和ＩＦＮ站丨用表達??８??


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