豆田雜草嚴重限制大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的提高,草甘膦的廣譜滅生性特點限制了它在作物田間的應(yīng)用。生物技術(shù)生產(chǎn)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物允許農(nóng)民使用草甘膦控制雜草。為獲得具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)基因大豆,本研究將G10-EPSPS基因通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入大豆品種中豆32中,獲得高抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆。通過對轉(zhuǎn)基因大豆后代的分子檢測,田間草甘膦抗性鑒定,轉(zhuǎn)錄組測序、對生物多樣性的影響分析,以及轉(zhuǎn)基因大豆的營養(yǎng)成分進行分析,得到以下結(jié)果:1.Southern結(jié)果表明G10-EPSPS基因已成功整合進大豆基因組中,并為單拷貝插入。Western及Elisa結(jié)果表明G10-EPSPS蛋白在轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉、花、莢皮和種子中均有表達。葉片中G10-EPSPS蛋白的含量最高。結(jié)莢期葉片中外源蛋白的含量顯著高于苗期。大豆籽粒中外源蛋白含量最低。轉(zhuǎn)基因大豆不同世代（T₇、T₈、T₉）葉片及種子中G10-EPSPS蛋白的含量沒有顯著差異,外源蛋白在不同世代間的表達穩(wěn)定。田間試驗表明,該轉(zhuǎn)基因大豆能耐受高濃度的草甘膦。T₁代對草甘... 

【文章來源】：上海交通大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

pSOY19質(zhì)粒圖

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文第2章37圖2-2.大豆改進的半粒法遺傳轉(zhuǎn)化步驟注：(a)半種子用農(nóng)桿菌侵染30分鐘；(b)半種子和農(nóng)桿菌在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天；(c)外植體在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長14天；(d)切掉上部1/3子葉的外植體在新鮮的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長14天；(e)從伸長培養(yǎng)基上長出伸長芽；(f)伸長芽在1/2MS培養(yǎng)基上生根；(g)來自于一個外植體的幾個轉(zhuǎn)化體；(h)轉(zhuǎn)化植株結(jié)實情況。Fig.2-2.StepsoftheimprovedhalfseedstransformationsysteminsoybeanNote：(a)half-seedswereinfectedwithAgrobacteriumfor30min.(b)half-seedsandAgrobacteriumwereco-culturedonco-culturemediumfor4days.(c)explantswereculturedonSImediumfor14days.(d)explantswerecutby1/3toppartandtransferredonfreshSImediumfor14days.(e)shootswereregeneratingfromexplantsinSEmedium.(f)shootswererootingin1/2MSmedium.(g)genetictransformationplantsobtainedfromoneexplant.(h)podssettingoftransformationsoybeanplant.2.3.2轉(zhuǎn)基因大豆的分子檢測2.3.2.1PCR檢測對來自一個外植體的4株T0代大豆植株用CTAB法少量提取植物基因組DNA，PCR結(jié)果顯示所檢測的4株植株均為陽性（圖2-3）。

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文第2章38圖2-3.T0代植株P(guān)CR結(jié)果注：泳道1：Marker;泳道2：陰性非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓�；泳�?-6：陽性轉(zhuǎn)基因植株；泳道7：ddH2O；泳道8：陽性對照質(zhì)粒。Fig.2-3.PCRresultsoftheT0generationplantsNote：Lane1:Marker;Lane2:NegativeCKplant;Lane3-6:PCRpositivetransformationplant;Lane7:ddH2O;Lane8:PositiveplasmidCK.2.3.2.2Southern分析采用XbaI，HindIII，EcoRI酶切大豆基因組DNA，與地高辛標(biāo)記的G10-EPSPS基因片段制作的探針雜交，結(jié)果顯示（圖2-4）G10-EPSPS基因已成功整合進入大豆基因組中，并為單拷貝插入。圖2-4.T1代植株SouthernBlot分析注:泳道1:陽性質(zhì)粒DNA用XbaI酶切；泳道2:陰性非轉(zhuǎn)基因植株DNA用XbaI酶切；泳道3-5:陽性轉(zhuǎn)基因植株DNA用EcoRI,HindIII,XbaI酶切.Fig.2-4.SouthernblotanalysisofT1generationplant.Note:Lane1:positivecontrolplasmidDNAdigestedwithXbaI;Lane2:non-transformednegativecontrolplantgenomicDNAdigestedwithXbaI;Lane3-5:positivetransgenicplantgenomicDNAdigestedwithEcoRI,HindIII,XbaI.2.3.2.3EPSPS基因的實時定量表達（qRT-PCR）各組織G10-EPSPS基因在RNA水平上的表達情況如圖2-5：

【參考文獻】：
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本文編號：3055532