本研究以CRISPR/dCas9技術(shù)為基礎(chǔ),在sgRNA的3′端添加長度為24 bp的捕獲序列使之成為捕獲sgRNA（Capture sgRNA,csgRNA）,與dCas9形成復(fù)合物后,csgRNA可以指導(dǎo)dCas9尋靶并結(jié)合到目標序列上。利用堿基互補的原理,dCas9-csgRNA復(fù)合物上的捕獲序列可以與帶有互補單鏈的線性DNA片段發(fā)生互作,從而實現(xiàn)了以下實驗?zāi)康?（1）將帶有互補單鏈的線性CMV片段錨定到目標基因的啟動子區(qū),使之以反式增強子（Trans enhancer）的方式實現(xiàn)對目標基因的轉(zhuǎn)錄激活,使目標基因表達水平增高,實現(xiàn)特定的細胞生物學(xué)目的;（2）使用dCas9-csgRNA復(fù)合物在體外靶向結(jié)合目標DNA序列,然后借助帶有互補單鏈線性DNA片段的磁珠富集目標DNA后建庫測序;（3）使用dCas9-csgRNA復(fù)合物在細胞內(nèi)靶向結(jié)合目的DNA（啟動子）,然后借助帶有互補單鏈線性DNA片段的磁珠富集參與調(diào)控目標基因調(diào)控的調(diào)控序列和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。本論文研究內(nèi)容分為以下三個部分:1.用反式增強子方法實現(xiàn)對目標基因的轉(zhuǎn)錄激活從pEGFP-N1載體上擴增出平末端CMV序列（blun... 

【文章來源】：東南大學(xué)江蘇省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：130 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)介紹
        1.1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的來源和分類
        1.1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用和研究進展
        1.1.3 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的改進和應(yīng)用拓展
    1.2 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其治療價值
        1.2.1 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控紊亂與疾病的關(guān)系
        1.2.2 基因表達調(diào)控紊亂的成因
        1.2.3 基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的實現(xiàn)方法和應(yīng)用前景
    1.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因突變對腫瘤發(fā)生的影響
        1.3.1 癌基因的過度活化
        1.3.2 抑癌基因的異常表達
        1.3.3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控與靶向醫(yī)療
        1.3.4 一些重要的腫瘤基因
    1.4 研究意義和內(nèi)容
第2章 反式增強子特異性激活目標基因轉(zhuǎn)錄
    2.1 引言
    2.2 材料與方法
        2.2.1 主要實驗材料及儀器
    2.3 載體構(gòu)建
        2.3.1 dCas9和sgRNA表達載體的構(gòu)建
        2.3.2 與csgRNA捕獲序列互補結(jié)合的sCMV片段的制備方法
        2.3.3 sgRNA的改造及其功能驗證
    2.4細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染實驗
        2.4.1 反式增強子原理驗證
        2.4.2 對比不同轉(zhuǎn)錄激活方法對目標基因的激活效果
        2.4.3 對比不同轉(zhuǎn)錄激活方法在多種細胞的激活效果
        2.4.4 激活HNF4a基因轉(zhuǎn)錄表達后對HepG2 細胞侵襲能力的影響
        2.4.5 HepG2 細胞激活HNF4a后對遷移能力的影響
        2.4.6 激活HNF4a后對HepG2 細胞功能基因的影響
        2.4.7 激活E47 后對PANC-1 細胞的影響
    2.5 結(jié)果
        2.5.1 使用CRISPR輔助的反式增強子激活目標基因
        2.5.2 捕獲序列對sgRNA功能的影響
        2.5.3 使用反式增強子激活外源報告載體
        2.5.4 反式增強子與VPR的轉(zhuǎn)錄效果比較
        2.5.5 反式增強子方法激活內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄表達
        2.5.6 使用反式增強子激活腫瘤細胞分化基因
        2.5.7 由VPR和 CMV組成的反式增強子激活內(nèi)源基因
    2.6 本章小結(jié)
第3章 csgRNA體外靶向富集目標區(qū)域
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 主要儀器和材料
        3.2.2 細胞培養(yǎng)和提取總DNA
        3.2.3 Tn5 酶切基因組和片段回收
        3.2.4 制備csgRNA
        3.2.5 目標片段的靶向富集和建庫測序
        3.2.6 測序結(jié)果分析
        3.2.7 比較不同數(shù)量csgRNA組合對富集結(jié)果的影響
        3.2.8 從模擬混合樣品的富集突變序列
    3.3 結(jié)果和討論
        3.3.1 原理示意圖
        3.3.2 Tn5 酶切基因組和片段回收
        3.3.3 基因組樣品的靶向富集和建庫測序
        3.3.4 比較293T和293Tm樣品的測序結(jié)果
        3.3.5 各種細胞系所屬的突變
        3.3.6 模擬混合樣品的靶向富集
    3.4 小結(jié)
第4章 csgRNA靶向富集調(diào)控序列和轉(zhuǎn)錄因子
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 主要試劑材料及儀器
        4.2.2 載體構(gòu)建
        4.2.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
        4.2.4 甲醛交聯(lián)、染色質(zhì)片段化和富集目標序列
        4.2.5 磁珠的包被和目標序列的捕獲
        4.2.6 核酸建庫和蛋白樣品處理
        4.2.7 測序結(jié)果分析
        4.2.8 質(zhì)譜結(jié)果分析
        4.2.9 基因組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測與篩選
    4.3 結(jié)果和討論
        4.3.1 原理示意圖
        4.3.2 核酸建庫檢測
        4.3.3 核酸樣品的測序結(jié)果
        4.3.4 調(diào)控序列的模體分析
        4.3.5 蛋白質(zhì)譜結(jié)果
    4.4 小結(jié)
第5章 總結(jié)與展望
參考文獻
作者簡介
    個人履歷
    攻讀博士學(xué)位期間參與的科研項目
    攻讀博士學(xué)位期間已發(fā)表及投稿中的學(xué)術(shù)論文、申報的專利
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]Modeling the causal regulatory network by integrating chromatin accessibility and transcriptome data[J]. Yong Wang,Rui Jiang,Wing Hung Wong.  National Science Review. 2016(02)
[2]Sox2, a key factor in the regulation of pluripotency and neural differentiation[J]. Shuchen Zhang,Wei Cui.  World Journal of Stem Cells. 2014(03)
[3]Embryonic stem cell factors and pancreatic cancer[J]. Marta Herreros-Villanueva,Luis Bujanda,Daniel D Billadeau,Jin-San Zhang.  World Journal of Gastroenterology. 2014(09)



本文編號：3054395