目的:幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,H.pylori）是已知與人類胃及十二指腸疾病相關最重要的細菌,virB2和virB11為幽門螺桿菌可塑性區(qū)IV型分泌系統(tǒng)tfs3a基因簇結構基因,它們的生物學功能特性在目前可獲得的文獻中很少報道。為此,本論文以以H.pylori臨床分離株H.pylori WH-21可塑性區(qū)virB2和virB11基因及其蛋白作為研究對象,通過分子生物學、免疫學和生物信息學進一步研究virB2和virB11基因及其編碼產物,為進一步研究H.pylori致病機制及診斷和治療等奠定基礎。方法:1.Karmali培養(yǎng)基微需氧環(huán)境中培養(yǎng)H.pylori WH-21菌株。2.PCR法構建virB11基因的原核表達載體,IPTG法誘導宿主表達,Ni²⁺-NTA法純化融合蛋白,利用尿素梯度透析復性蛋白免疫家兔制備抗重組VirB11蛋白多克隆抗血清。3.Western blotting法檢測VirB11蛋白的亞細胞定位,免疫共沉淀實驗和質譜分析方法進行VirB11蛋白的互作蛋白分析。4.將不同濃度的純化的VirB11蛋白與人正常胃上皮細胞GES-1共培養(yǎng),并測定共培養(yǎng)后上清液中的IL-8含量。5.合成VirB2蛋白,與正常胃上皮細胞GES-1共培養(yǎng)進行MTT實驗,用小鼠制備多克隆抗體,測定抗體效價。6.使用生物信息學軟件分析virB2和virB11基因編碼蛋白的理化性質、細胞定位、信號肽及空間結構等。結果:1.使用H.pylori WH-21菌株為模板,成功獲得了長度為940bp的virB11基因的全長片段。2.通過構建virB11基因的原核表達載體pET28a-virB11,誘導純化獲得VirB11蛋白,免疫雄兔,獲得了效價為1:16000的兔抗-VirB11多克隆抗體。3.測定了VirB11蛋白和GES-1共培養(yǎng)的上清液IL-8濃度,結果表明VirB11蛋白的細胞毒性有濃度依賴性,在一定程度上說明宿主炎癥的產生與VirB11蛋白的存在有一定的關系。4.通過免疫印跡法、質譜等分析方法,利用免疫雄兔制備的VirB11蛋白的多克隆抗體對VirB11蛋白進行研究的結果表明,VirB11定位于細胞內膜,與ATP合酶β亞基（ATP syntheses subunit beta）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenate）、胞液氨基肽酶（cytosol aminopeptidase）和F0F1ATP合酶α亞基（F0F1 ATP syntheses subunit alpha）和蘋果酸:醌氧化還原酶（malate:quinone oxidoreductase）等存在相互作用。5.利用合成的VirB2蛋白獲得了鼠抗-VirB2多克隆抗體,明確了VirB2蛋白是一種有濃度依賴性細胞毒作用的蛋白。6.生物學軟件分析顯示,virB11基因編碼的蛋白質VirB11蛋白的等電點為8.46,VirB11蛋白由313個氨基組成,它的分子量為36kDa,屬于親水性穩(wěn)定蛋白,空間結構呈六聚體通道狀,進一步證實VirB11蛋白參與ATP代謝的功能。virB2基因編碼的蛋白質VirB2蛋白的等電點為9.56,VirB2蛋白由313個氨基組成,它的分子量為11kDa,但是它同VirB11蛋白不一樣,屬于疏水性穩(wěn)定蛋白。結論:1.通過生物學軟件分析,明確了VirB2蛋白是疏水性的穩(wěn)定蛋白而VirB11蛋白則是一種親水性的穩(wěn)定性蛋白。2.明確了VirB11定位于細胞內膜,與ATP合酶β亞基（ATP syntheses subunit beta）、異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase）、胞液氨基肽酶（cytosol aminopeptidase）和F0F1ATP合酶α亞基（F0F1 ATP syntheses subunit alpha）和蘋果酸:醌氧化還原酶（malate:quinone oxidoreductase）等存在相互作用。進一步證實了VirB11蛋白的ATP代謝相關性。3.明顯提示VirB11蛋白與細胞分泌IL-8及組織炎癥的發(fā)生有關。4.明確了VirB2蛋白的抗原性以及濃度依賴細胞毒的作用。 

【文章來源】：大連醫(yī)科大學遼寧省

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
    參考文獻
第一部分 H.pylori virB11 基因功能研究
    （一）材料和方法
        1 材料
            1.1 實驗菌株和載體
            1.2 主要試劑
            1.3 主要溶液的配制
            1.4 主要儀器
        2 方法
            2.1 H.pylori的培養(yǎng)與鑒定
            2.2 H.pylori DNA的提取
            2.3 設計合成virB11 基因的引物
            2.4 PCR克隆virB11 基因
            2.5 PCR產物的膠回收
            2.6 制備E.coli DH5α感受態(tài)
            2.7 virB11 基因的T-A連接反應
            2.8 連接產物轉化E.coli DH5α感受態(tài)細菌
            2.9 virB11 重組質粒的篩選和提取
            2.10 構建、鑒定virB11 重組原核表達的質粒
            2.11 VirB11 融合蛋白的誘導表達和純化
            2.12 制備VirB11 蛋白的多克隆抗體
            2.13 重組VirB11 蛋白的多克隆抗體效價測定
            2.14 H.pylori分離組分和亞細胞定位
            2.15 VirB11 蛋白的互作蛋白分析
            2.16 virB11 基因推導編碼產物的獲得及生物信息學分析
            2.17 免疫共沉淀中VirB11 蛋白及互作蛋白的驗證
            2.18 VirB11 蛋白與GES-1 細胞共培養(yǎng)上清液的IL-8 檢測
    （二）結果
        1.1 H.pylori WH-21 菌株的分離培養(yǎng)與鑒定鑒定
        1.2 H.pylori virB11 基因片段的PCR擴增
        1.3 virB11 基因的克隆與鑒定
        1.4 構建并分析virB11 基因重組表達質粒
        1.5 VirB11 重組蛋白的誘導表達及鑒定
        1.6 純化VirB11 重組蛋白與測定抗體效價
        1.7 定位VirB11 蛋白在細胞內的位置
        1.8 分析VirB11 蛋白的互作蛋白
        1.9 分析VirB11 蛋白的理化特性
        1.10 預測VirB11 蛋白信號肽和跨膜區(qū)
        1.11 預測VirB11 蛋白二級結構
        1.12 VirB11 蛋白卷曲螺旋的預測分析
        1.13 VirB11 蛋白三維結構預測
        1.14 檢測共培養(yǎng)上清液中IL-8的濃度
    （三）討論
    （四）結論
    （五）參考文獻
第二部分 H.pylori virB2 基因功能的研究
    （一）材料和方法
        1 材料
            1.1 合成VirB2 蛋白
            1.2 主要試劑
            1.3 主要溶液配制
            1.4 主要儀器
        2 方法
            2.1 VirB2 蛋白的生物信息學分析
            2.2 VirB2 蛋白與GES-1 細胞共培養(yǎng)及MTT實驗
            2.3 VirB2 蛋白的多克隆抗體制備
            2.4 VirB2 蛋白的多克隆抗體效價測定
    （二）結果
        1.1 VirB2 蛋白的理化特性分析
        1.2 VirB11 蛋白信號肽和跨膜區(qū)的預測
        1.3 VirB11 蛋白二級結構的預測
        1.4 VirB11 蛋白卷曲螺旋的預測分析
        1.5 VirB11 蛋白三維結構預測
        1.6 VirB2 蛋白與GES-1 細胞共培養(yǎng)及MTT實驗分析
        1.7 VirB2 蛋白的多克隆抗體效價測定
    （三）討論
    （四）結論
    （五）參考文獻
綜述 幽門螺桿菌毒力因子的相關研究
    參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表文章情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3046591