BRD4蛋白是BET蛋白家族最重要的成員,在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、DNA復(fù)制與修復(fù)、細(xì)胞周期等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),包括急性髓系白血病、多發(fā)性骨髓瘤、伯基特淋巴瘤、NUT中線癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的一員,BRD4也對保持染色質(zhì)高度有序的結(jié)構(gòu)具有重要作用,介導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子在基因增強(qiáng)子上的招募,從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄激活。由于m RNA成熟過程中的可變剪接,BRD4蛋白存在兩個亞型,長亞型（BRD4L）和短亞型（BRD4S）。BRD4S（氨基酸1-722）包含了BRD4L的N端區(qū)域的719個氨基酸,和C端的三個與BRD4L不同的氨基酸,GPA。目前,對于BRD4L長亞型蛋白的研究較多,而對于BRD4短亞型的功能還知之甚少。液-液相分離（LLPS）是指兩種液體不溶于一種均一液相中,產(chǎn)生了不同的相-相分離的現(xiàn)象。當(dāng)溶液中的生物大分子例如蛋白質(zhì)或者核酸經(jīng)歷液-液相分離時,它們會聚集在一個密集的類似液滴相中,與此同時也形成一個稀疏的相。越來越多的研究表明,液-液相分離是細(xì)胞內(nèi)形成無膜隔間的機(jī)制。液-液相分離在生物體內(nèi)普遍存在,在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯、表觀遺傳... 

【文章來源】：吉林大學(xué)吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

液-液相分離受多種因素影響[42]

研究報道,BRD4L蛋白質(zhì)長亞型的C-末端能夠與介導(dǎo)蛋白Med1在超級增強(qiáng)子區(qū)域形成液-液相分離[89],為了研究BRD4S或者BRD4L的N末端氨基酸序列是否具有形成液-液相分離的能力,我們在體外表達(dá)純化了BRD4S(1-719),并且用熒光標(biāo)簽Alexa-Fluor 488進(jìn)行標(biāo)記。熒光共聚焦顯微鏡下觀察到,在體外低鹽條件下(65 mM NaCl,2%PEG-6000),BRD4S(1-719)在0.5μM蛋白質(zhì)濃度形成液-液相分離的液滴(圖3.1A)。并且,隨著BRD4S(1-719)蛋白質(zhì)濃度的增加,其形成的相分離的液滴的數(shù)量及總面積均相應(yīng)增加,這說明BRD4S(1-719)在體外條件下形成的液-液相分離具有濃度依賴性(圖3.1B)。為了確定BRD4短亞型蛋白質(zhì)形成液滴的關(guān)鍵氨基酸序列,我們表達(dá)純化了含EGFP熒光標(biāo)簽的兩段BRD4S截短型蛋白質(zhì)EGFP-BD2-CPS(347-720)和EGFP-BD1-BD2(44-477)(圖3.2A)。結(jié)果顯示,EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白質(zhì)在室溫及低鹽條件下均可形成球狀的液-液相分離的液滴,而EGFP-BD1-BD2的相分離液滴與EGFP-BD2-CPS的液滴相比數(shù)量較少,體積較小(圖3.2B)。EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白質(zhì)的液滴在加入2%的PEG-6000前后未見明顯變化,說明BRD4S蛋白質(zhì)片段無需PEG-6000就能夠形成液相分離;游離的EGFP標(biāo)簽蛋白質(zhì)分子分別在有無PEG-6000條件下均呈澄清狀態(tài)(圖3.2C),未見EGFP標(biāo)簽蛋白質(zhì)對BRD4S蛋白質(zhì)的液滴形成的影響。為了進(jìn)一步證明BRD4S蛋白質(zhì)形成的液-液相分離并非由EGFP導(dǎo)致,我們純化了野生型BRD4 WT-BD2-CPS和WT-BD1-BD2蛋白質(zhì)(圖3.2A),顯微鏡下顯示W(wǎng)T-BD2-CPS以及WT-BD1-BD2蛋白質(zhì)的液-液相分離的液滴,但較EGFP-BRD4融合蛋白質(zhì)(EGFP-BD2-CPS、EGFP-BD1-BD2)形成的液滴較弱(圖3.2B),可能是由于EGFP增加了蛋白質(zhì)分子氨基酸序列的長度,相對蛋白質(zhì)分子體積更大,增加了蛋白質(zhì)分子間多共價作用,促進(jìn)液態(tài)相分離的形成。

為了確定BRD4短亞型蛋白質(zhì)形成液滴的關(guān)鍵氨基酸序列,我們表達(dá)純化了含EGFP熒光標(biāo)簽的兩段BRD4S截短型蛋白質(zhì)EGFP-BD2-CPS(347-720)和EGFP-BD1-BD2(44-477)(圖3.2A)。結(jié)果顯示,EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白質(zhì)在室溫及低鹽條件下均可形成球狀的液-液相分離的液滴,而EGFP-BD1-BD2的相分離液滴與EGFP-BD2-CPS的液滴相比數(shù)量較少,體積較小(圖3.2B)。EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白質(zhì)的液滴在加入2%的PEG-6000前后未見明顯變化,說明BRD4S蛋白質(zhì)片段無需PEG-6000就能夠形成液相分離;游離的EGFP標(biāo)簽蛋白質(zhì)分子分別在有無PEG-6000條件下均呈澄清狀態(tài)(圖3.2C),未見EGFP標(biāo)簽蛋白質(zhì)對BRD4S蛋白質(zhì)的液滴形成的影響。為了進(jìn)一步證明BRD4S蛋白質(zhì)形成的液-液相分離并非由EGFP導(dǎo)致,我們純化了野生型BRD4 WT-BD2-CPS和WT-BD1-BD2蛋白質(zhì)(圖3.2A),顯微鏡下顯示W(wǎng)T-BD2-CPS以及WT-BD1-BD2蛋白質(zhì)的液-液相分離的液滴,但較EGFP-BRD4融合蛋白質(zhì)(EGFP-BD2-CPS、EGFP-BD1-BD2)形成的液滴較弱(圖3.2B),可能是由于EGFP增加了蛋白質(zhì)分子氨基酸序列的長度,相對蛋白質(zhì)分子體積更大,增加了蛋白質(zhì)分子間多共價作用,促進(jìn)液態(tài)相分離的形成。為了驗(yàn)證BRD4S蛋白質(zhì)液滴的相分離特性,我們檢測了EGFP-BD2-CPS和EGFP-BD1-BD2蛋白質(zhì)在不同蛋白質(zhì)及鹽濃度條件下的LLPS。結(jié)果顯示,這兩種蛋白質(zhì)形成的液滴均隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增強(qiáng),隨鹽離子強(qiáng)度(NaCl濃度)的增加而減弱(圖3.3A,B)。例如:EGFP-BD2-CPS在體外條件下形成的LLPS,在鹽濃度50-350 mM及蛋白質(zhì)濃度5-60μM范圍內(nèi),對溶液鹽濃度及蛋白質(zhì)濃度變化呈依賴性,隨蛋白質(zhì)濃度的增加而增強(qiáng),隨鹽離子強(qiáng)度(NaCl濃度)的增加而減弱(圖3.3C)。


本文編號：3043058