本文關(guān)鍵詞：髓系腫瘤中miR-378基因5’側(cè)翼區(qū)甲基化態(tài)勢的臨床研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的研究造血系統(tǒng)髓系腫瘤急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)、慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)以及骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者miR-378基因5’側(cè)翼區(qū)甲基化態(tài)勢,并統(tǒng)計分析其臨床相關(guān)性。方法應(yīng)用實時定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技術(shù)檢測AML患者miR-378基因表達水平,并用實時定量甲基化特異性PCR(real-time quantitative methylation-specific PCR,RQ-MSP)分別檢測AML、CML、MDS患者miR-378基因5’側(cè)翼區(qū)甲基化水平。亞硫酸氫鹽測序(bisulfite sequencing PCR)技術(shù)用來分析患者miR-378基因5’側(cè)翼區(qū)的甲基化密度。結(jié)果造血系統(tǒng)髓系腫瘤中均存在不同程度的miR-378基因5’側(cè)翼區(qū)低甲基化。(1)130例AML患者中54例(41.5%)為miR-378低甲基化,甲基化改變與患者的性別、年齡、外周血血小板計數(shù)、血紅蛋白含量、白細胞計數(shù)、原始細胞比例均無關(guān)(P0.05)。低甲基化頻率與患者的FAB、WHO分型及染色體危險度分組不相關(guān)(P0.05),但在FAB分型中,M2型患者的低甲基化程度明顯高于其他組。此外,miR-378低甲基化與染色體分型有關(guān),且t(8;21)易位患者存在程度較高的miR-378低甲基化改變。在AML患者中并未發(fā)現(xiàn)miR-378甲基化與表達相關(guān),但THP-1細胞株經(jīng)過去甲基化藥物5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-aza-dC)處理后重新出現(xiàn)了表達上調(diào)和甲基化水平的下降,miR-378基因甲基化程度與完全緩解及總體生存時間(overall survival time,OS)無關(guān)(P0.05)。(2)52例CML患者中19例(36.5%)出現(xiàn)miR-378低甲基化,miR-378基因甲基化改變與患者性別、年齡、外周血血紅蛋白含量、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、BCR/ABL相對含量、染色體核型分組均無相關(guān)性(P0.05)。不同分期之間低甲基化頻率急變期(2/7,28.5%)慢性期(15/40,38%))加速期(2/5,40%),但三組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(3)95例MDS患者中有20例(21.1%)存在miR-378低甲基化,miR-378基因甲基化改變與患者年齡、外周血白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、血紅蛋白計數(shù)均無關(guān)(P0.05),但男性患者miR-378基因低甲基化陽性率(15/55,27.3%)明顯高于女性患者(4/40,10.0%)(P=0.04);低甲基化頻率與染色體核型危險度分組、WHO分型、FAB分組、IPSS分組無相關(guān)性(P0.05);生存分析顯示在全部MDS患者和年齡小于60歲患者,miR-378低甲基化患者的OS均明顯短于miR-378高甲基化患者(P=0.036,P=0.027)。此外,Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)miR-378低甲基化是年齡小于60患者OS的獨立預(yù)后影響因素之一。結(jié)論(1)MiR-378基因5’側(cè)翼區(qū)低甲基化是急慢性髓系白血病中常見的分子事件;(2)在AML患者中miR-378低甲基化與染色體分型有關(guān),且t(8;21)易位患者存在程度較高的miR-378低甲基化改變;(3)MiR-378低甲基化是60歲以下MDS患者預(yù)后不良的獨立影響因素。
【關(guān)鍵詞】：MiR-378基因 甲基化 AML CML MDS RQ-PCR RQ-MSP BSP
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7;R551.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 英文縮略語13-16
• 第一章 引言16-26
• 1.1 微小RNA16-17
• 1.2 微小RNA與腫瘤17-19
• 1.3 微小RNA與表觀遺傳學(xué)調(diào)控19-20
• 1.4 DNA甲基化與髓系腫瘤20-26
• 1.4.1 AML22-23
• 1.4.2 CML23-24
• 1.4.3 MDS24-26
• 第二章 本論文研究的目的、方法及實驗方案的設(shè)計、意義26-30
• 2.1 研究背景及目的26
• 2.2 研究方法及技術(shù)26-28
• 2.2.1 實時熒光定量PCR（RQ-PCR）26-27
• 2.2.2 實時定量甲基化特異性PCR（RQ-MSP）27-28
• 2.2.3 亞硫酸氫鹽測序（Bisulfite sequencing PCR, BSP）28
• 2.3 實驗方案的設(shè)計28-29
• 2.4 本研究的意義29-30
• 第三章 AML患者中miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化研究30-54
• 3.1 材料30-32
• 3.1.1 研究對象30
• 3.1.2 主要儀器30-31
• 3.1.3 主要試劑31-32
• 3.1.4 引物32
• 3.2 方法32-41
• 3.2.1 細胞培養(yǎng)和藥物處理32
• 3.2.2 骨髓單個核細胞的分離、全部mRNA及基因組DNA的提取32-33
• 3.2.3 DNA硫化修飾（Epitect? Bisulfite Kit修飾DNA）33-34
• 3.2.4 逆轉(zhuǎn)錄34
• 3.2.5 MiR-378基因表達的RQ-PCR檢測34-35
• 3.2.6 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)的RQ-MSP檢測35-37
• 3.2.7 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)BSP分析37
• 3.2.8 純化回收PCR產(chǎn)物37-38
• 3.2.9 構(gòu)建重組載體38
• 3.2.10 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化38-39
• 3.2.11 重組質(zhì)粒提取及測序、鑒定39-40
• 3.2.12 建立陽性模板40
• 3.2.13 細胞遺傳學(xué)檢測40-41
• 3.2.14 基因突變檢測41
• 3.2.15 統(tǒng)計學(xué)處理41
• 3.3 結(jié)果41-51
• 3.3.1 RQ-MSP靈敏度、重復(fù)性、特異性41-43
• 3.3.2 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)CpG島43-44
• 3.3.3 對照組miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化水平44-45
• 3.3.4 AML患者miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化水平與臨床相關(guān)性45-47
• 3.3.5 MiR-378基因甲基化態(tài)勢與AML患者染色體核型分析47-48
• 3.3.6 AML患者miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化密度分析48-49
• 3.3.7 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化與表達相關(guān)性分析49-51
• 3.3.8 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化態(tài)勢與AML患者預(yù)后分析51
• 3.4 討論51-54
• 第四章 CML患者中miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化研究54-60
• 4.1 材料54
• 4.1.1 研究對象54
• 4.1.2 主要儀器54
• 4.1.3 主要試劑54
• 4.1.4 引物54
• 4.2 方法54-55
• 4.2.1 骨髓單個核細胞分離及基因組DNA制備54-55
• 4.2.2 DNA硫化修飾55
• 4.2.3 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)RQ-MSP檢測55
• 4.2.4 純化回收PCR產(chǎn)物55
• 4.2.5 構(gòu)建重組載體55
• 4.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化55
• 4.2.7 重組質(zhì)拉提取及測序、鑒定55
• 4.2.8 建立陽性模板55
• 4.2.9 細胞遺傳學(xué)檢查55
• 4.2.10統(tǒng)計學(xué)處理55
• 4.3 結(jié)果55-58
• 4.3.1 CML患者和對照組miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化水平55-57
• 4.3.2 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化水平與臨床相關(guān)性57
• 4.3.3 不同分期CML患者miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化水平57-58
• 4.4 討論58-60
• 第五章 MDS患者中MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化研究60-70
• 5.1 材料60-61
• 5.1.1 研究對象60
• 5.1.2 主要儀器60
• 5.1.3 主要試劑60-61
• 5.1.4 引物61
• 5.2 方法61-62
• 5.2.0 BMMNCs 分離及基因組 DNA 制備61
• 5.2.1 DNA 硫化修飾61
• 5.2.2 mi R-378 基因 5’側(cè)翼區(qū) RQ-MSP 檢測61
• 5.2.3 miR-378基因5’側(cè)翼區(qū) BSP 分析61
• 5.2.4 PCR 擴增產(chǎn)物純化回收61
• 5.2.5 重組載體構(gòu)建61
• 5.2.6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化61
• 5.2.7 重組質(zhì)拉提取及測序、鑒定61
• 5.2.8 建立陽性模板61
• 5.2.9 細胞遺傳學(xué)檢查61
• 5.2.10 基因突變檢測61-62
• 5.2.11 統(tǒng)計學(xué)處理62
• 5.3 結(jié)果62-68
• 5.3.1 MDS患者和對照組miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化水平62-63
• 5.3.2 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化水平與臨床相關(guān)性63-65
• 5.3.3 MDS患者miR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化密度分析65
• 5.3.4 MiR-378基因 5’側(cè)翼區(qū)甲基化態(tài)勢與MDS患者預(yù)后分析65-68
• 5.4 討論68-70
• 第六章 結(jié)論和展望70-71
• 6.1 主要結(jié)論70
• 6.2 展望70-71
• 參考文獻71-82
• 致謝82-84
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果84

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7 徐酩;呂京o

本文編號：303779