隨著斑馬魚(yú)（Danio rerio）基因組測(cè)序工作的完成,研究人員發(fā)現(xiàn)斑馬魚(yú)與人類（Homo sapiens）基因同源性較高,針對(duì)這一特點(diǎn),研究人員構(gòu)建了多種人類疾病的斑馬魚(yú)模型,用于探究疾病發(fā)生機(jī)制�；蚓庉嫾夹g(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了斑馬魚(yú)基因功能研究的發(fā)展,先進(jìn)的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9系統(tǒng),因其簡(jiǎn)單高效正廣泛被應(yīng)用。本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除斑馬魚(yú)lncRNA基因啟動(dòng)子區(qū)以及將dCas9基因敲入斑馬魚(yú)基因組。本文主要的研究?jī)?nèi)容如下：1、為了研究Nondret002679在斑馬魚(yú)胚胎各時(shí)期以及成年后各組織中的表達(dá)規(guī)律,首先收集0 hpf（合子期）、3 hpf（囊胚期）、6 hpf（原腸期）、12hpf（體節(jié)期/5-體節(jié)）、24hpf（咽囊期）及48hpf（孵化期）的斑馬魚(yú)胚胎提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用熒光定量PCR （RT-qPCR）方法檢測(cè)Nondmt002679的表達(dá)規(guī)律。同時(shí)收集成年斑馬魚(yú)的心臟、肝臟、睪丸、卵巢、肌肉、尾鰭7組織樣,同樣采用RT-qPCR方法檢測(cè)Nondret002679的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示,24 h時(shí)Nondret002679表達(dá)量... 

【文章來(lái)源】：揚(yáng)州大學(xué)江蘇省

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
符號(hào)說(shuō)明
引言
文獻(xiàn)綜述
    1 斑馬魚(yú)研究進(jìn)展
        1.1 模式生物斑馬魚(yú)簡(jiǎn)介
        1.2 斑馬魚(yú)研究歷史
        1.3 斑馬魚(yú)在人類疾病研究中的應(yīng)用
    2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)研究進(jìn)展
        2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)介
            2.1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)研究歷史
            2.1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)介
        2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲除
        2.3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因敲入
        2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因調(diào)控
        2.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)與其它基因編輯技術(shù)的比較
    3 本研究的立題依據(jù)及研究意義
        3.1 初步探究Nondret002679表達(dá)規(guī)律及其啟動(dòng)子區(qū)敲除
        3.2 dCas9斑馬魚(yú)模型的構(gòu)建
    4 研究展望
第一章 探究Nondret002679在斑馬魚(yú)胚胎各階段及各組織的表達(dá)規(guī)律
    前言
    1 材料與方法
        1.1 試驗(yàn)試劑
        1.2 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.3 試驗(yàn)動(dòng)物
        1.4 斑馬魚(yú)胚胎的各階段以及各組織中Nondret002679表達(dá)量的差異分析
            1.4.0 各階段斑馬魚(yú)胚胎的收集
            1.4.1 成年斑馬魚(yú)的解剖
            1.4.2 采用TRIzoL試劑提取胚胎中的總RNA
            1.4.3 RNA濃度的檢測(cè)
            1.4.4 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA
            1.4.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)
            1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    2 結(jié)果與分析
        2.1 Nondret002679在斑馬魚(yú)胚胎各階段表達(dá)量的差異分析
        2.2 Nondret002679在斑馬魚(yú)的各組織中表達(dá)量的差異分析
    3 討論
第二章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的Nondret002679啟動(dòng)子區(qū)敲除
    前言
    1 材料與方法
        1.1 實(shí)驗(yàn)儀器
        1.2 試驗(yàn)試劑
        1.3 Nondret002679靶位點(diǎn)的選擇
        1.4 gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板的合成及轉(zhuǎn)錄
            1.4.1 gRNA體外轉(zhuǎn)錄模板的合成
            1.4.2 gRNA的體外轉(zhuǎn)錄
        1.5 Cas9 mRNA體外轉(zhuǎn)錄
        1.6 顯微注射及敲除鑒定
            1.6.1 顯微注射
            1.6.2 斑馬魚(yú)DNA的提取
            1.6.3 Nondret002679啟動(dòng)子區(qū)敲除鑒定
        1.7 啟動(dòng)子區(qū)缺失的斑馬魚(yú)的純合鑒定
        1.8 啟動(dòng)子區(qū)敲除的雜合斑馬魚(yú)Nondret002679的表達(dá)分析
    2 結(jié)果
        2.1 早期斑馬魚(yú)敲除鑒定結(jié)果
        2.2 2月齡斑馬魚(yú)敲除鑒定結(jié)果
        2.3 啟動(dòng)子區(qū)缺失的純合斑馬魚(yú)的獲得
        2.4 啟動(dòng)子區(qū)敲除的雜合斑馬魚(yú)Nondret002679的表達(dá)分析結(jié)果
    3 討論
第三章 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的dCas9定點(diǎn)敲入斑馬魚(yú)基因組模型的構(gòu)建
    前言
    1 材料與方法
        1.1 材料
        1.2 儀器設(shè)備
        1.3 dCas9 donor載體構(gòu)建引物的設(shè)計(jì)與合成
        1.4 dCas9 donor載體的構(gòu)建
        1.5 靶位點(diǎn)的選擇
        1.6 顯微注射及敲入鑒定
        1.7 雜合斑馬魚(yú)的dCas9的表達(dá)分析
    2 結(jié)果與分析
        2.1 dCas9敲入斑馬魚(yú)基因組的鑒定結(jié)果
        2.2 純合dCas9斑馬魚(yú)鑒定結(jié)果
        2.3 雜合斑馬魚(yú)的dCas9表達(dá)分析結(jié)果
    3 討論
全文結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 常振儀,嚴(yán)維,劉東風(fēng),陳竹鋒,謝剛,盧嘉威,吳建新,唐曉艷.  農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào). 2015(09)
[2]Development of Novel Visual-Plus Quantitative Analysis Systems for Studying DNA Double-Strand Break Repairs in Zebrafish[J]. Jingang Liu(a,1),Lu Gong(a,1),Changqing Chang(b,1,2),Cong Liuc,Jinrong Peng(b,),Jun Chen(a,) a College of Life Sciences,Zhejiang University,866 Yu Hang Tang Road,Hangzhou 310058,China b College of Animal Sciences,Zhejiang University,866 Yu Hang Tang Road,Hangzhou 310058,China c Developmental and Stem Cell Institute,West China Second University Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,China 2 Present address:College of Natural Resources and Environment,South China Agricultural University,Guangzhou 510650,China..  遺傳學(xué)報(bào). 2012(09)
[3]斑馬魚(yú)與人類疾病模型的研究[J]. 徐振華,趙慕鈞,李載平.  生命的化學(xué). 2002(04)



本文編號(hào)：3036101