目的探討siRNA靶向沉默Notch1基因?qū)細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的增殖及凋亡作用的影響,以及對(duì)T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞Notch1/c-Myc信號(hào)通路的影響。方法選取Jurkat細(xì)胞作為T細(xì)胞淋巴瘤模型,取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行如下實(shí)驗(yàn)研究。提取DNA進(jìn)行Notch1基因的外顯子27、34進(jìn)行測序,測定其突變位點(diǎn),利用RNA干擾技術(shù)（RNAi）合成兩段小干擾RNA序列（siRNAⅠ和siRNAⅡ）靶向沉默Notch1基因。在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h之后,利用共聚焦顯微鏡觀看轉(zhuǎn)染的綠色熒光（慢病毒攜帶）,然后用嘌呤霉素篩選成功轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定的細(xì)胞株（慢病毒載體攜帶抗嘌呤霉素基因）。用篩選好的轉(zhuǎn)染成功的Jurkat細(xì)胞進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)研究。每項(xiàng)試驗(yàn)至少重復(fù)三次。利用CCK-8法分析轉(zhuǎn)染后的Jurkat細(xì)胞的活力;分別提取Jurkat細(xì)胞總RNA和總蛋白,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和蛋白免疫印跡（Western Blot）檢測Notch1及其靶基因c-Myc和凋亡基因Caspase3 m RNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平;并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測siRNA靶向沉默Notch1基因?qū)urkat細(xì)胞凋亡的影響。利用單因素方... 

【文章來源】：青島大學(xué)山東省

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

Notch1基因突變檢測

研究發(fā)現(xiàn) siNotch1 能明顯降低 Jurkat 細(xì)胞的活RNA 轉(zhuǎn)染組Ⅱ分別與細(xì)胞對(duì)照組和 siRNA 陰性對(duì)照組有表 3 和圖 3 所示。表 3 Jurkat 細(xì)胞增殖能力分組 x±s P 值胞對(duì)照組 1.000 0.000A 陰性對(duì)照組 0.867 0.107 P=0.139*NA 轉(zhuǎn)染組Ⅰ 0.472 0.202 P=0.000* P=0.001**NA 轉(zhuǎn)染組Ⅱ 0.468 0.063 P=0.000* P=0.001** 胞活力分析。 x 代表平均數(shù)，s 表示標(biāo)準(zhǔn)差。*P 值表示與細(xì)胞對(duì) siRNA 陰性對(duì)照組相比所得的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；***P 值表示 siRNA 轉(zhuǎn)。

17圖 4 siNotch1 基因增加 Jurkat 細(xì)胞的凋亡率（A）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析：**siRNA 轉(zhuǎn)染組Ⅰ和 siRNA 轉(zhuǎn)染組Ⅱ分別與細(xì)胞對(duì)照組相比有明顯差異（P=0.000，P=0.002）；### siRNA 轉(zhuǎn)染組Ⅰ和 siRNA 轉(zhuǎn)染組Ⅱ分別與 siRNA 陰性對(duì)照組比有明顯的差異（P=0.000，P=0.002）；并且細(xì)胞對(duì)照組和 siRNA 陰性對(duì)照組之間沒有差異（P=0.891）, siRNA 轉(zhuǎn)染組Ⅰ和 siRNA 轉(zhuǎn)染組Ⅱ相比有明顯的差異（P=0.000）。（B）使用流細(xì)胞術(shù)利用凋亡檢測試劑盒（Annexin V-APC 和 PI）檢測 Jurkat 細(xì)胞凋亡率的變化。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：3031387