肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）催化松柏醛生成松柏醇,是華細辛主要藥理活性成分甲基丁香酚生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。分離CAD基因并進行功能驗證是調(diào)控華細辛甲基丁香酚生物合成的基礎(chǔ)工作。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選到華細辛7個可能的CAD基因轉(zhuǎn)錄本（AsGAD1～7）,同時通過同源克隆獲得1個華細辛CAD基因（AsCAD）;對上述8個基因進行了生物信息學(xué)分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,初步預(yù)測了華細辛CAD基因家族成員的特征;利用實時熒光定量PCR篩選出華細辛在不同生長時期及不同組織中進行基因表達定量分析時適宜的內(nèi)參基因18SrRNA,在此基礎(chǔ)上,進行AsCADs差異表達分析;利用Gateway技術(shù)構(gòu)建AsCAD基因過表達載體pK7FWG2.0-AsGAD,通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,檢測木質(zhì)素含量,驗證基因功能。主要研究結(jié)果如下:（1）基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選出7個可能的華細辛GAD家族成員,分別命名為AsCAD1～7,向NCBI提交后,在GenBank中的登陸號分別為KY446440～KY446446。利用生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件對AsCADs... 

【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：103 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 綜述
    1.1 華細辛種質(zhì)資源研究概況
        1.1.1 細辛屬植物系統(tǒng)分類概況
        1.1.2 華細辛生長發(fā)育特征與資源現(xiàn)狀
    1.2 中藥細辛研究進展
        1.2.1 細辛藥理活性成分與應(yīng)用價值
        1.2.2 細辛毒性與安全用藥
    1.3 甲基丁香酚研究進展
        1.3.1 甲基丁香酚生物合成途徑
        1.3.2 甲基丁香酚應(yīng)用價值
    1.4 CAD研究概況
        1.4.1 CAD蛋白結(jié)構(gòu)特征與酶學(xué)特性
        1.4.2 CAD在植物生長發(fā)育中作用
        1.4.3 CAD家族成員的分類
        1.4.4 CAD基因差異表達分析
        1.4.5 CAD基因克隆與功能驗證
    1.5 立題背景與意義
第二章 基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫華細辛CAD基因的挖掘
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
    2.3 實驗方法
        2.3.1 華細辛CAD基因的挖掘
        2.3.2 華細辛CAD結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測
        2.3.3 華細辛CAD系統(tǒng)發(fā)育分析
    2.4 實驗結(jié)果與討論
        2.4.1 華細辛CAD基因的挖掘
        2.4.2 華細辛CAD結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測
        2.4.3 華細辛CAD系統(tǒng)進化分析
    2.5 本章小結(jié)
第三章 華細辛CAD基因的同源克隆與分析
    3.1 引言
    3.2 實驗器材
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗試劑
        3.2.3 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 華細辛葉片總RNA提取
        3.3.2 華細辛cDNA合成
        3.3.3 華細辛CAD基因保守片段克隆
        3.3.4 華細辛CAD基因5'RACE與3'RACE擴增
        3.3.5 華細辛CAD基因cDNA全長的獲得
        3.3.6 華細辛CAD基因生物信息學(xué)分析
        3.3.7 CAD系統(tǒng)發(fā)育分析
    3.4 實驗結(jié)果與討論
        3.4.1 華細辛葉片總RNA提取
        3.4.2 華細辛CAD基因克隆引物設(shè)計
        3.4.3 華細辛CAD基因保守片段的克隆以及5'/3'RACE擴增
        3.4.4 華細辛CAD基因cDNA全長的獲得
        3.4.5 華細辛CAD基因生物信息學(xué)分析
        3.4.6 CAD系統(tǒng)發(fā)育分析
    3.5 本章小結(jié)
第四章 華細辛實時熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選
    4.1 引言
    4.2 實驗器材
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗試劑
        4.2.3 實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 華細辛不同生長時期不同組織總RNA提取
        4.3.2 華細辛cDNA合成
        4.3.3 候選內(nèi)參基因選擇與引物設(shè)計
        4.3.4 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系與程序設(shè)定
        4.3.5 實時熒光定量PCR內(nèi)參篩選相關(guān)軟件
    4.4 實驗結(jié)果與討論
        4.4.1 華細辛不同生長時期不同組織總RNA提取
        4.4.2 實時熒光定量PCR內(nèi)參篩選相關(guān)軟件分析結(jié)果
    4.5 本章小結(jié)
第五章 華細辛CAD基因差異表達分析
    5.1 引言
    5.2 實驗器材
    5.3 實驗方法
        5.3.1 華細辛總RNA提取與cDNA合成
        5.3.2 AsCADs熒光定量PCR引物設(shè)計與程序設(shè)定
        5.3.3 AsCADs表達分析
    5.4 實驗結(jié)果與討論
        5.4.1 華細辛不同生長時期不同組織總RNA提取
        5.4.2 AsCADs熒光定量PCR引物設(shè)計
        5.4.3 AsCADs熒光定量PCR引物特異性分析
        5.4.4 AsCADs表達分析
    5.5 本章小結(jié)
第六章 AsCAD基因轉(zhuǎn)擬南芥真核表達分析
    6.1 引言
    6.2 實驗器材
        6.2.1 實驗材料
        6.2.2 菌株與載體
        6.2.3 主要培養(yǎng)基
        6.2.4 主要試劑與儀器
    6.3 實驗方法
        6.3.1 表達載體構(gòu)建
        6.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌GV3101
        6.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥
        6.3.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性植株篩選
        6.3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥木質(zhì)素含量測定
    6.4 結(jié)果與討論
        6.4.1 表達載體構(gòu)建
        6.4.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的獲得
        6.4.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR驗證結(jié)果
        6.4.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥木質(zhì)素含量測定結(jié)果
    6.5 本章小結(jié)
第七章 研究總結(jié)與展望
    7.1 研究總結(jié)
    7.2 工作展望
參考文獻
附錄Ⅰ
附錄Ⅱ
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[2]甲基丁香酚對桔小實蠅的誘集日動態(tài)及其緩釋方法[J]. 薛超,許益鐫,曾玲.  環(huán)境昆蟲學(xué)報. 2015(01)
[3]藥用植物功能基因的研究思路與展望——以甘草為例[J]. 劉春生,劉穎.  中國實驗方劑學(xué)雜志. 2015(01)
[4]木質(zhì)素生物合成中肉桂醇脫氫酶基因（CAD）的研究進展[J]. 曹佳強,李波,楊洋,胡文冉,王玉晶,范玲.  分子植物育種. 2014(05)
[5]馬尾松CAD基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測[J]. 張逢凱,潘婷,盛璐,季孔庶.  分子植物育種. 2014(04)
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[8]超聲輔助提取華細辛揮發(fā)油中甲基丁香酚工藝優(yōu)化[J]. 歐陽天贄,袁泉.  天然產(chǎn)物研究與開發(fā). 2013(02)
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博士論文
[1]擬南芥4CL3基因在類黃酮合成代謝中的功能分析[D]. 林建中.湖南大學(xué) 2009

碩士論文
[1]蠟梅肉桂醇脫氫酶基因CpCAD的克隆、表達特性分析及功能驗證[D]. 李志菜.西南大學(xué) 2013



本文編號：3022614