肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase,CAD）催化松柏醛生成松柏醇,是華細(xì)辛主要藥理活性成分甲基丁香酚生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。分離CAD基因并進(jìn)行功能驗證是調(diào)控華細(xì)辛甲基丁香酚生物合成的基礎(chǔ)工作。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選到華細(xì)辛7個可能的CAD基因轉(zhuǎn)錄本（AsGAD1～7）,同時通過同源克隆獲得1個華細(xì)辛CAD基因（AsCAD）;對上述8個基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,初步預(yù)測了華細(xì)辛CAD基因家族成員的特征;利用實時熒光定量PCR篩選出華細(xì)辛在不同生長時期及不同組織中進(jìn)行基因表達(dá)定量分析時適宜的內(nèi)參基因18SrRNA,在此基礎(chǔ)上,進(jìn)行AsCADs差異表達(dá)分析;利用Gateway技術(shù)構(gòu)建AsCAD基因過表達(dá)載體pK7FWG2.0-AsGAD,通過浸花法轉(zhuǎn)化擬南芥,檢測木質(zhì)素含量,驗證基因功能。主要研究結(jié)果如下:（1）基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選出7個可能的華細(xì)辛GAD家族成員,分別命名為AsCAD1～7,向NCBI提交后,在GenBank中的登陸號分別為KY446440～KY446446。利用生物信息學(xué)相關(guān)分析軟件對AsCADs... 

【文章來源】：華東師范大學(xué)上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：103 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 綜述
    1.1 華細(xì)辛種質(zhì)資源研究概況
        1.1.1 細(xì)辛屬植物系統(tǒng)分類概況
        1.1.2 華細(xì)辛生長發(fā)育特征與資源現(xiàn)狀
    1.2 中藥細(xì)辛研究進(jìn)展
        1.2.1 細(xì)辛藥理活性成分與應(yīng)用價值
        1.2.2 細(xì)辛毒性與安全用藥
    1.3 甲基丁香酚研究進(jìn)展
        1.3.1 甲基丁香酚生物合成途徑
        1.3.2 甲基丁香酚應(yīng)用價值
    1.4 CAD研究概況
        1.4.1 CAD蛋白結(jié)構(gòu)特征與酶學(xué)特性
        1.4.2 CAD在植物生長發(fā)育中作用
        1.4.3 CAD家族成員的分類
        1.4.4 CAD基因差異表達(dá)分析
        1.4.5 CAD基因克隆與功能驗證
    1.5 立題背景與意義
第二章 基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫華細(xì)辛CAD基因的挖掘
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
    2.3 實驗方法
        2.3.1 華細(xì)辛CAD基因的挖掘
        2.3.2 華細(xì)辛CAD結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測
        2.3.3 華細(xì)辛CAD系統(tǒng)發(fā)育分析
    2.4 實驗結(jié)果與討論
        2.4.1 華細(xì)辛CAD基因的挖掘
        2.4.2 華細(xì)辛CAD結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測
        2.4.3 華細(xì)辛CAD系統(tǒng)進(jìn)化分析
    2.5 本章小結(jié)
第三章 華細(xì)辛CAD基因的同源克隆與分析
    3.1 引言
    3.2 實驗器材
        3.2.1 實驗材料
        3.2.2 實驗試劑
        3.2.3 實驗儀器
    3.3 實驗方法
        3.3.1 華細(xì)辛葉片總RNA提取
        3.3.2 華細(xì)辛cDNA合成
        3.3.3 華細(xì)辛CAD基因保守片段克隆
        3.3.4 華細(xì)辛CAD基因5'RACE與3'RACE擴增
        3.3.5 華細(xì)辛CAD基因cDNA全長的獲得
        3.3.6 華細(xì)辛CAD基因生物信息學(xué)分析
        3.3.7 CAD系統(tǒng)發(fā)育分析
    3.4 實驗結(jié)果與討論
        3.4.1 華細(xì)辛葉片總RNA提取
        3.4.2 華細(xì)辛CAD基因克隆引物設(shè)計
        3.4.3 華細(xì)辛CAD基因保守片段的克隆以及5'/3'RACE擴增
        3.4.4 華細(xì)辛CAD基因cDNA全長的獲得
        3.4.5 華細(xì)辛CAD基因生物信息學(xué)分析
        3.4.6 CAD系統(tǒng)發(fā)育分析
    3.5 本章小結(jié)
第四章 華細(xì)辛實時熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選
    4.1 引言
    4.2 實驗器材
        4.2.1 實驗材料
        4.2.2 實驗試劑
        4.2.3 實驗儀器
    4.3 實驗方法
        4.3.1 華細(xì)辛不同生長時期不同組織總RNA提取
        4.3.2 華細(xì)辛cDNA合成
        4.3.3 候選內(nèi)參基因選擇與引物設(shè)計
        4.3.4 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系與程序設(shè)定
        4.3.5 實時熒光定量PCR內(nèi)參篩選相關(guān)軟件
    4.4 實驗結(jié)果與討論
        4.4.1 華細(xì)辛不同生長時期不同組織總RNA提取
        4.4.2 實時熒光定量PCR內(nèi)參篩選相關(guān)軟件分析結(jié)果
    4.5 本章小結(jié)
第五章 華細(xì)辛CAD基因差異表達(dá)分析
    5.1 引言
    5.2 實驗器材
    5.3 實驗方法
        5.3.1 華細(xì)辛總RNA提取與cDNA合成
        5.3.2 AsCADs熒光定量PCR引物設(shè)計與程序設(shè)定
        5.3.3 AsCADs表達(dá)分析
    5.4 實驗結(jié)果與討論
        5.4.1 華細(xì)辛不同生長時期不同組織總RNA提取
        5.4.2 AsCADs熒光定量PCR引物設(shè)計
        5.4.3 AsCADs熒光定量PCR引物特異性分析
        5.4.4 AsCADs表達(dá)分析
    5.5 本章小結(jié)
第六章 AsCAD基因轉(zhuǎn)擬南芥真核表達(dá)分析
    6.1 引言
    6.2 實驗器材
        6.2.1 實驗材料
        6.2.2 菌株與載體
        6.2.3 主要培養(yǎng)基
        6.2.4 主要試劑與儀器
    6.3 實驗方法
        6.3.1 表達(dá)載體構(gòu)建
        6.3.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌GV3101
        6.3.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化擬南芥
        6.3.4 擬南芥轉(zhuǎn)基因陽性植株篩選
        6.3.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥木質(zhì)素含量測定
    6.4 結(jié)果與討論
        6.4.1 表達(dá)載體構(gòu)建
        6.4.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株的獲得
        6.4.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR驗證結(jié)果
        6.4.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥木質(zhì)素含量測定結(jié)果
    6.5 本章小結(jié)
第七章 研究總結(jié)與展望
    7.1 研究總結(jié)
    7.2 工作展望
參考文獻(xiàn)
附錄Ⅰ
附錄Ⅱ
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]細(xì)辛揮發(fā)油成分提取與甲基丁香酚含量測定的研究進(jìn)展[J]. 潘磊,鄭柳,牛卉,趙曉冰,柳威,劉忠.  時珍國醫(yī)國藥. 2015(04)
[2]甲基丁香酚對桔小實蠅的誘集日動態(tài)及其緩釋方法[J]. 薛超,許益鐫,曾玲.  環(huán)境昆蟲學(xué)報. 2015(01)
[3]藥用植物功能基因的研究思路與展望——以甘草為例[J]. 劉春生,劉穎.  中國實驗方劑學(xué)雜志. 2015(01)
[4]木質(zhì)素生物合成中肉桂醇脫氫酶基因（CAD）的研究進(jìn)展[J]. 曹佳強,李波,楊洋,胡文冉,王玉晶,范玲.  分子植物育種. 2014(05)
[5]馬尾松CAD基因的克隆及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測[J]. 張逢凱,潘婷,盛璐,季孔庶.  分子植物育種. 2014(04)
[6]參與農(nóng)桿菌侵染及T-DNA轉(zhuǎn)運過程植物蛋白的研究進(jìn)展和思考[J]. 趙佩,王軻,張偉,杜麗璞,葉興國.  中國農(nóng)業(yè)科學(xué). 2014(13)
[7]中草藥細(xì)辛研究進(jìn)展[J]. 王曉麗,金禮吉,續(xù)繁星,徐永平,李曉宇.  亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥. 2013(07)
[8]超聲輔助提取華細(xì)辛揮發(fā)油中甲基丁香酚工藝優(yōu)化[J]. 歐陽天贄,袁泉.  天然產(chǎn)物研究與開發(fā). 2013(02)
[9]細(xì)辛煎煮過程中甲基丁香酚、黃樟醚和細(xì)辛脂素的變化研究[J]. 黃鮫,易進(jìn)海,劉玉紅,黃志芳,陳燕,劉云華.  中成藥. 2012(10)
[10]生物信息學(xué)研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 趙屹,谷瑞升,杜生明.  醫(yī)學(xué)信息學(xué)雜志. 2012(05)

博士論文
[1]擬南芥4CL3基因在類黃酮合成代謝中的功能分析[D]. 林建中.湖南大學(xué) 2009

碩士論文
[1]蠟梅肉桂醇脫氫酶基因CpCAD的克隆、表達(dá)特性分析及功能驗證[D]. 李志菜.西南大學(xué) 2013



本文編號：3022614