稻瘟病由病原真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染引起,是水稻三大病害之一,對水稻中抗稻瘟病基因功能的分析有助于揭示水稻抗稻瘟病的機制,加快水稻抗病育種進程。本實驗室前期通過GWAS分析得到的一個與抗稻瘟病相關(guān)、編碼氧化還原酶的基因pi-G3,本文對該基因的功能進行了初步研究。分別構(gòu)建了該基因CRISPR/Cas9敲除載體和超表達載體,通過農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株。對獲得的轉(zhuǎn)基因植株利用打孔接種和ROS測定等實驗進行抗病表型及相關(guān)生理生化指標鑒定,同時對該基因進行亞細胞定位。初步證明了pi-G3參與水稻抗稻瘟病的功能。具體研究結(jié)果如下:1、設(shè)計pi-G3基因編輯靶點構(gòu)建CRISPR/Cas9載體pYB02-pi-G3,同時PCR擴增pi-G3 CDS全長構(gòu)建超表達載體pROXs-HA-pi-G3,通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植株。2、對轉(zhuǎn)基因植株進行普通PCR測序以及熒光定量PCR鑒定pi-G3基因型及轉(zhuǎn)錄水平變化,獲得CRISPR突變體pi-G3-7-4,pi-G3-5-5;野生型:pi-G3-9-1;超表達植株:pi-G3-12-13,pi-G3-12-5。3、稻... 

【文章來源】：湖南農(nóng)業(yè)大學湖南省

【文章頁數(shù)】：56 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 稻瘟病對水稻的危害及防護措施
    1.2 植物抗病機制
    1.3 水稻抗稻瘟病研究進展
    1.4 氧化還原酶參與植物抗病反應
    1.5 生物信息學分析在水稻抗稻瘟病基因克隆研究中的應用
    1.6 CRISPR系統(tǒng)在植物種的應用
    1.7 目的和意義
第2章 候選基因的獲得及克隆
    2.1 實驗材料
        2.1.1 稻瘟菌小種,水稻材料,載體和菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要實驗設(shè)備
        2.1.4 培養(yǎng)基的主要成分及其配置方法
        2.1.5 抗生素使用濃度
    2.2 實驗方法
        2.2.0 稻瘟菌培養(yǎng)
        2.2.1 常用菌種保存
        2.2.2 水稻葉片cDNA獲得
        2.2.3 引物設(shè)計
        2.2.4 CRISPR/Cas9 載體構(gòu)建
        2.2.5 超表達載體pROXs-HA載體構(gòu)建
        2.2.6 亞細胞定位載體構(gòu)建
        2.2.7 原核表達載體構(gòu)建
    2.3 實驗結(jié)果和分析
        2.3.1 候選基因的獲得
        2.3.2 載體的構(gòu)建及鑒定
    2.4 討論
第3章 pi-G3 功能初探
    3.1 實驗材料
        3.1.1 稻瘟菌生理小種,水稻轉(zhuǎn)基因材料
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 主要實驗設(shè)備
        3.1.4 培養(yǎng)基的主要成分及其配置方法
    3.2 實驗方法
        3.2.1 水稻葉片DNA提取
        3.2.2 實時熒光定量PCR
        3.2.3 蛋白提取和Western blot檢測
        3.2.4 ROS檢測
        3.2.5 Punch打孔接種
        3.2.6 真菌生物量檢測
        3.2.7 潮霉素篩選
    3.3 實驗結(jié)果和分析
        3.3.1 pi-G3 CRISPR敲除突變體及超表達材料鑒定
        3.3.2 pi-G3 CRISPR敲除突變體抗性表型鑒定
        3.3.3 pi-G3 超表達突變體抗性表型鑒定
        3.3.4 突變體常規(guī)表型鑒定
    3.4 討論
第4章 pi-G3 亞細胞定位以及原核表達
    4.1 實驗材料
        4.1.1 水稻品種,載體
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 實驗設(shè)備
        4.1.4 培養(yǎng)基以及試劑的主要成分及其配置方法
    4.2 實驗方法
        4.2.1 酶液配制
        4.2.2 原生質(zhì)體提取
        4.2.3 水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化過程
        4.2.4 原核表達
    4.3 實驗結(jié)果與分析
        4.3.1 pi-G3 亞細胞定位
        4.3.2 pi-G3 原核表達
    4.4 討論
參考文獻
致謝
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]水稻廣譜抗性負調(diào)控基因OsSSI2的克隆及原核表達[J]. 陳亞紅,劉早利,王春臺,劉新瓊.  廣東農(nóng)業(yè)科學. 2016(04)
[2]水稻抗稻瘟病基因研究進展[J]. 王丹,曹志,肖應輝.  南方農(nóng)業(yè). 2015(30)
[3]水稻先天免疫系統(tǒng)對南方黑條矮縮病的抗性分析[J]. 唐建淮,馮銳,郭輝.  農(nóng)技服務(wù). 2015(05)
[4]幾種新型植物基因表達載體的構(gòu)建方法[J]. 張陽璞,楊淑慎.  生物工程學報. 2015(03)
[5]水稻抗白葉枯病基因xa5的原核表達及蛋白純化[J]. 范玉龍,張夢詩,李明容,翟文學,夏志輝.  熱帶農(nóng)業(yè)科學. 2015(03)
[6]水稻抗白葉枯病相關(guān)基因的亞細胞定位[J]. 陳斌,李冬月,王栩鳴,周潔,嚴成其,陳劍平.  浙江農(nóng)業(yè)學報. 2014(03)
[7]水稻稻瘟病抗性基因的定位、克隆及育種應用研究進展[J]. 何秀英,王玲,吳偉懷,陳釗明,林菲,程永盛,劉維,陳粵漢,廖耀平.  中國農(nóng)學通報. 2014(06)
[8]水稻Os03g19020基因的克隆及亞細胞定位分析[J]. 柏錫,賈蓓,呂德康,朱延明,才華,紀巍.  東北農(nóng)業(yè)大學學報. 2014(01)
[9]包涵體蛋白復性技術(shù)研究進展[J]. 包義風,應蓮芳,蔣琳.  微生物學免疫學進展. 2012(02)
[10]稻瘟病監(jiān)測預測方法研究現(xiàn)狀及流行風險評估體系構(gòu)建初探[J]. 齊龍,馬旭,梁柏,張穩(wěn)成,傅榮富,譚永炘.  中國農(nóng)學通報. 2011(33)

博士論文
[1]水稻細菌性條斑病菌Ⅲ型效應因子功能的研究[D]. 李帥.中國農(nóng)業(yè)大學 2015

碩士論文
[1]小麥赤霉病菌三個同源CYP51基因表達載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 王小蟬.安徽農(nóng)業(yè)大學 2016
[2]ABIP1在稻瘟病Pib-AvrPib互作系統(tǒng)中的功能研究[D]. 陳文婷.華南農(nóng)業(yè)大學 2016
[3]水稻品種Jefferson和谷梅2號廣譜抗稻瘟病基因的發(fā)掘與定位[D]. 江南.湖南農(nóng)業(yè)大學 2010
[4]水稻抗瘟性的生化機制研究[D]. 宋海超.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學 2003



本文編號：3018691