稻瘟病由病原真菌稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）侵染引起,是水稻三大病害之一,對水稻中抗稻瘟病基因功能的分析有助于揭示水稻抗稻瘟病的機制,加快水稻抗病育種進程。本實驗室前期通過GWAS分析得到的一個與抗稻瘟病相關、編碼氧化還原酶的基因pi-G3,本文對該基因的功能進行了初步研究。分別構建了該基因CRISPR/Cas9敲除載體和超表達載體,通過農桿菌介導轉化獲得轉基因植株。對獲得的轉基因植株利用打孔接種和ROS測定等實驗進行抗病表型及相關生理生化指標鑒定,同時對該基因進行亞細胞定位。初步證明了pi-G3參與水稻抗稻瘟病的功能。具體研究結果如下:1、設計pi-G3基因編輯靶點構建CRISPR/Cas9載體pYB02-pi-G3,同時PCR擴增pi-G3 CDS全長構建超表達載體pROXs-HA-pi-G3,通過農桿菌轉化獲得轉基因植株。2、對轉基因植株進行普通PCR測序以及熒光定量PCR鑒定pi-G3基因型及轉錄水平變化,獲得CRISPR突變體pi-G3-7-4,pi-G3-5-5;野生型:pi-G3-9-1;超表達植株:pi-G3-12-13,pi-G3-12-5。3、稻... 

【文章來源】：湖南農業(yè)大學湖南省

【文章頁數】：56 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第1章 緒論
    1.1 稻瘟病對水稻的危害及防護措施
    1.2 植物抗病機制
    1.3 水稻抗稻瘟病研究進展
    1.4 氧化還原酶參與植物抗病反應
    1.5 生物信息學分析在水稻抗稻瘟病基因克隆研究中的應用
    1.6 CRISPR系統(tǒng)在植物種的應用
    1.7 目的和意義
第2章 候選基因的獲得及克隆
    2.1 實驗材料
        2.1.1 稻瘟菌小種,水稻材料,載體和菌株
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 主要實驗設備
        2.1.4 培養(yǎng)基的主要成分及其配置方法
        2.1.5 抗生素使用濃度
    2.2 實驗方法
        2.2.0 稻瘟菌培養(yǎng)
        2.2.1 常用菌種保存
        2.2.2 水稻葉片cDNA獲得
        2.2.3 引物設計
        2.2.4 CRISPR/Cas9 載體構建
        2.2.5 超表達載體pROXs-HA載體構建
        2.2.6 亞細胞定位載體構建
        2.2.7 原核表達載體構建
    2.3 實驗結果和分析
        2.3.1 候選基因的獲得
        2.3.2 載體的構建及鑒定
    2.4 討論
第3章 pi-G3 功能初探
    3.1 實驗材料
        3.1.1 稻瘟菌生理小種,水稻轉基因材料
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 主要實驗設備
        3.1.4 培養(yǎng)基的主要成分及其配置方法
    3.2 實驗方法
        3.2.1 水稻葉片DNA提取
        3.2.2 實時熒光定量PCR
        3.2.3 蛋白提取和Western blot檢測
        3.2.4 ROS檢測
        3.2.5 Punch打孔接種
        3.2.6 真菌生物量檢測
        3.2.7 潮霉素篩選
    3.3 實驗結果和分析
        3.3.1 pi-G3 CRISPR敲除突變體及超表達材料鑒定
        3.3.2 pi-G3 CRISPR敲除突變體抗性表型鑒定
        3.3.3 pi-G3 超表達突變體抗性表型鑒定
        3.3.4 突變體常規(guī)表型鑒定
    3.4 討論
第4章 pi-G3 亞細胞定位以及原核表達
    4.1 實驗材料
        4.1.1 水稻品種,載體
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 實驗設備
        4.1.4 培養(yǎng)基以及試劑的主要成分及其配置方法
    4.2 實驗方法
        4.2.1 酶液配制
        4.2.2 原生質體提取
        4.2.3 水稻原生質體轉化過程
        4.2.4 原核表達
    4.3 實驗結果與分析
        4.3.1 pi-G3 亞細胞定位
        4.3.2 pi-G3 原核表達
    4.4 討論
參考文獻
致謝
作者簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3018691