基因的表達(dá)調(diào)控與基因組在細(xì)胞核內(nèi)的三維空間架構(gòu)相輔相成,原鈣粘蛋白（protocadherin, Pcdh）基因簇在大腦發(fā)育中起到關(guān)鍵作用,可以作為研究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的模式基因。轉(zhuǎn)錄因子RFX5 （regulatory factor x 5）是翼螺旋家族（winged HLH family）的成員,其蛋白由寡聚化結(jié)構(gòu)域、DNA結(jié)合域、螺旋結(jié)構(gòu)域和激活域組成,在調(diào)控免疫系統(tǒng)的主要組織相容性復(fù)合物II類（major histocompatibility complex class II, MHC II）的表達(dá)中起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)RFX5與CTCF在全基因組上結(jié)合的位點有部分重疊,利用CRISPR/Cas9DNA大片段編輯技術(shù),構(gòu)建了RFX5基因缺失的HEC-1-B細(xì)胞系。通過RNA-seq實驗,發(fā)現(xiàn)RFX5敲除能夠顯著升高Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2的表達(dá)水平。通過ChIP-nexus實驗,發(fā)現(xiàn)敲除RFX5導(dǎo)致染色質(zhì)架構(gòu)蛋白CTCF和cohesin在原鈣粘蛋白α基因簇處的結(jié)合增加。最后,染色質(zhì)構(gòu)象捕獲QHR-4C實驗發(fā)現(xiàn)Pcdhα6、Pcdhα12啟動子與遠(yuǎn)端... 

【文章來源】：遺傳. 2020,42(08)北大核心

【文章頁數(shù)】：15 頁

【部分圖文】：

使用CRISPR/Cas9技術(shù)建立RFX5基因敲除的單細(xì)胞克隆株

本研究使用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過導(dǎo)入兩個sgRNA，將Cas9蛋白定位在目的片段處進(jìn)行切割，造成DNA雙鏈斷裂，經(jīng)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制得到RFX5基因敲除的單細(xì)胞克隆株K30和K56。K30的兩條染色體有一個堿基不同，而K56兩條染色體基因型相同。本研究對這兩個單細(xì)胞克隆株的RNA-seq、ChIP-nexus、以及染色質(zhì)構(gòu)象捕獲實驗發(fā)現(xiàn)，RFX5敲除后，Pcdhα6、Pcdhα12、Pcdhαc2轉(zhuǎn)錄升高。推測這些轉(zhuǎn)錄水平變化是由于RFX5敲除后，蛋白CTCF和cohesin在原鈣粘蛋白α基因簇的結(jié)合升高，使得增強(qiáng)子與啟動子之間的染色質(zhì)相互作用增加而導(dǎo)致的(圖5)。該現(xiàn)象表明RFX5蛋白通過抑制CTCF和cohesin與DNA的結(jié)合調(diào)控染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)，從而參與原鈣粘蛋白α基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(圖5)。然而通過ChIP-nexus和染色質(zhì)構(gòu)象捕獲QHR-4C實驗，發(fā)現(xiàn)敲除RFX5基因后，原鈣粘蛋白α基因簇中啟動子以及增強(qiáng)子HS5-1處的CTCF和cohesin的結(jié)合水平升高。在RFX5敲除的單細(xì)胞克隆株中，Pcdhα6和Pcdhα12啟動子處的CTCF/cohesin結(jié)合增加，以及這兩個啟動子與增強(qiáng)子HS5-1之間的染色質(zhì)相互作用增加，這些均能解釋Pcdhα6和Pcdhα12這兩個基因轉(zhuǎn)錄水平升高的現(xiàn)象。但是，RFX5的敲除如何上調(diào)Pcdhαc2的轉(zhuǎn)錄水平仍是未解決的問題。Pcdhαc2是原鈣粘蛋白α基因簇的特殊一員，它的啟動子上沒有CTCF蛋白的結(jié)合，并且它的轉(zhuǎn)錄不受增強(qiáng)子HS5-1的調(diào)控，而是由另外一個增強(qiáng)子HS7調(diào)控[12,57,58]。本研究在Pcdhαc2的啟動子上沒有發(fā)現(xiàn)RFX5的結(jié)合，但在增強(qiáng)子HS7上發(fā)現(xiàn)有RFX5的強(qiáng)結(jié)合，說明RFX5可能通過結(jié)合增強(qiáng)子HS7調(diào)控Pcdhαc2的轉(zhuǎn)錄。

基于RFX5對CTCF和cohesin復(fù)合體在原鈣粘蛋白α基因簇位點結(jié)合水平的影響，推測RFX5可能通過影響染色質(zhì)三維空間構(gòu)象從而調(diào)控原鈣粘蛋白α基因簇的表達(dá)，因此對原鈣粘蛋白α基因簇進(jìn)行可定量的高分辨率染色質(zhì)構(gòu)象捕獲(QHR-4C)實驗。該實驗?zāi)軌蜓芯磕硞�觀測點(viewpoint,VP)與全基因組其他位點之間的空間關(guān)系[15]。本研究首先以增強(qiáng)子HS5-1為觀測點，發(fā)現(xiàn)在野生型細(xì)胞中，HS5-1與Pcdhαc1以及Pcdhα6-Pcdhα12之間形成遠(yuǎn)距離的染色質(zhì)環(huán)(圖4A)。在RFX5敲除的兩個單細(xì)胞克隆株K30和K56中，HS5-1與這些基因之間的遠(yuǎn)距離相互作用增加(圖4A)。為了進(jìn)一步確定這些基因組位點間空間結(jié)構(gòu)的變化，選取Pcdhα12啟動子為觀測點，發(fā)現(xiàn)在RFX5基因敲除的兩個單細(xì)胞克隆株中，Pcdhα12與增強(qiáng)子HS5-1之間的遠(yuǎn)距離相互作用也同樣增加(圖4B)。這些結(jié)果說明，敲除RFX5基因后，原鈣粘蛋白α基因簇啟動子與遠(yuǎn)端增強(qiáng)子HS5-1之間的染色質(zhì)相互作用增強(qiáng)，這可能是Pcdhα基因表達(dá)上調(diào)的原因。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)敲除RFX5基因?qū)е略}粘蛋白α基因簇表達(dá)升高，并且RFX5會阻礙CTCF蛋白和cohesin蛋白復(fù)合體在原鈣粘蛋白α基因簇的結(jié)合。此外，RFX5參與調(diào)控染色質(zhì)環(huán)的形成，進(jìn)而影響染色質(zhì)三維空間結(jié)構(gòu)。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9基因編輯在三維基因組研究中的應(yīng)用[J]. 劉沛峰,吳強(qiáng).  遺傳. 2020(01)
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[3]CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組DNA片段編輯中的應(yīng)用[J]. 李金環(huán),壽佳,吳強(qiáng).  遺傳. 2015(10)
[4]人類原鈣粘蛋白基因簇調(diào)控元件的克隆及對其啟動子活性的影響[J]. 吳海洋,郭亞,李偉,吳強(qiáng).  生命科學(xué)研究. 2014(02)



本文編號：3015900