發(fā)布時間：2021-01-30 08:23

　　利用功能缺失型（Loss-of-function）或者功能獲得型（Gain-of-function）策略高通量篩選功能基因,是研究人員快速尋找調控特定表型的重要或關鍵基因的主要方法。RNA干擾（RNA interference,RNAi）的遺傳篩選方法因操作簡單、成本相對較低等優(yōu)勢,盡管已經(jīng)得到了廣泛的應用,然而其抑制效果不完全、脫靶效應明顯等劣勢依然存在。近年來興起的CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9）技術能快速、簡便、準確地實現(xiàn)基因組敲除等編輯功能,因而成為一種強大的遺傳篩選工具;在各種細胞系、人和小鼠及斑馬魚等多種模式動物中,大規(guī)模運用該方法篩選功能基因已經(jīng)取得了巨大成功。本文總結了CRISPR/Cas9技術的特點,將其與傳統(tǒng)基因工程方法進行了分析比較,回顧了近期相關的高通量功能基因篩選工作,最后探討了該技術未來的發(fā)展趨勢。 

【文章來源】：遺傳. 2016,38(05)北大核心

【文章頁數(shù)】：11 頁

【部分圖文】：

Cas9、sgRNA與DNA相互作用示意圖

抵薪?辛?篩眩首先他們在單倍體細胞系KBM7中以對6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine，嘌呤類似物)細胞致死作用的抗性為表型，篩選了參與DNA錯配修復通路(Mismatchrepair，MMR)的基因。MMR-proficient(pMMR，WT)細胞將無法修復6-硫代鳥嘌呤引發(fā)的細胞損害而停留在G2-M的細胞周期節(jié)點，而MMR-defective(dMMR，mutation)細胞將不識別錯配而繼續(xù)分裂。研究者們向Cas9-KBM7細胞系中轉染了整個sgRNA文庫，在濃度足以致死WTKBM76-硫代鳥嘌呤條件下培養(yǎng)，然后對存活細胞中表達的sgRNA進行測序。與預期的結果一致，觀察到被富圖2哺乳動物細胞中利用慢病毒CRISPR-Cas9系統(tǒng)的遺傳篩選流程Fig.2FlowchartofgeneticscreeninginmammaliancellsbyusingalentiviralCRISPR-Cas9system

396遺傳Hereditas(Beijing)2016第38卷圖3利用小鼠全基因組CRISPR-Cas9敲除文庫(mGeCKOa)的腫瘤生長和遷移篩選Fig.3CRISPRscreenoftumorgrowthandmetastasiswithmGeCKOalibrary細胞系，再用sgRNA混合文庫侵染。在培養(yǎng)1周之后，文庫穩(wěn)定表達并具有足夠的拷貝數(shù)與均勻性，然后將該細胞系(mGeCKOa-transduced)與對照組細胞系(Untransduced)各自移植到小鼠體內，并分別對早期腫瘤與晚期腫瘤的樣本進行分析。研究者們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)文庫侵染的一些細胞最終具有高遷移能力，而對照組細胞系形成的腫瘤均不具有遷移性。利用第二代測序技術，研究者們分別鑒定了在腫瘤原位與轉移灶處被敲除的基因，這些基因的功能可能是抑制腫瘤生長或遷移。在這些結果中，排名較高者包含了之前已經(jīng)被報道過的腫瘤抑制基因，NF2、Pten和Cdkn2a。此外，還有一些microRNA，如miR-345、miR152。Chen等[19]的工作為體內CRISPR篩選提供了一個完整的路線圖，這個模型在未來可能被更廣泛的應用于疾病的體內研究。全基因組CRISPR篩選可以應用于幾乎任何細胞系和任何遺傳背景下的遺傳篩選，比如EGFR、KRAS、ALK突變型，或其他人類腫瘤細胞系。而采用其他的遞送方法，比如靜脈注射或原位移植，將有助于鑒定那些在腫瘤外滲和成血管化過程中起作用的基因。此外，檢測不同時期與位置的腫瘤樣本，如循環(huán)腫瘤細胞(Circulatingtumorcells，CTCs)或已遷移腫瘤，可以更好的理解腫瘤在體內的演化過程。除此之外，體內CRISPR篩選模型還可以進行更細致的調整，以適應不同的實驗需要。將體內篩選策略與藥物治療或免疫治療共同運用，可以鑒定功能與抗性有關的基因。利用其他的篩選技術，如Cas9激活技術(Cas9-mediatedactivation)，可以作為一種功能獲得性篩選策略，鑒定在腫瘤遷移

【參考文獻】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas9的應用及脫靶效應研究進展[J]. 鄭武,谷峰.  遺傳. 2015(10)
[2]高通量siRNA篩選技術發(fā)展與展望[J]. 席建忠,馬明,王干誠,駱宇峰.  生命科學. 2014(03)
[3]CRISPR/Cas系統(tǒng):RNA靶向的基因組定向編輯新技術[J]. 李君,張毅,陳坤玲,單奇?zhèn)?王延鵬,梁振,高彩霞.  遺傳. 2013(11)



本文編號：3008585