發(fā)布時間：2021-01-28 02:36

　　目的構(gòu)建白念珠菌MTQ2基因缺失株,并檢測該基因缺失對細(xì)胞生長及遺傳毒性試劑耐受性的影響。方法采用整合型CRISPR/Cas9系統(tǒng),將sgRNA克隆到pV1093質(zhì)粒中,線性化后與含HIS1基因的修復(fù)DNA一起通過醋酸鋰法轉(zhuǎn)化白念珠菌野生型菌株SN148,于SD+NAT-His培養(yǎng)基篩選轉(zhuǎn)化子,通過PCR驗(yàn)證基因型,利用平板表型試驗(yàn)檢測MTQ2缺失對細(xì)胞生長及遺傳毒性試劑耐受性的影響。結(jié)果成功構(gòu)建了MTQ2純合子缺失菌株。MTQ2缺失導(dǎo)致串珠樣細(xì)胞比例（44.4%）較野生型菌株（2.5%）顯著增加,細(xì)胞增殖能力變?nèi)?生長缺陷明顯。結(jié)論利用整合型CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建了白念珠菌MTQ2純合子缺失菌株,且發(fā)現(xiàn)MTQ2基因可能參與維持細(xì)胞的增殖。 

【文章來源】：中國病原生物學(xué)雜志. 2020,15(09)北大核心

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

白念珠菌和釀酒酵母Mtq2氨基酸序列比對

采用整合型CRISPR/Cas9系統(tǒng)[13]構(gòu)建MTQ2缺失株。將融合的sgRNA片段克隆到pV1093質(zhì)粒的BsmBⅠ位點(diǎn)(圖2-A),EcoRⅠ酶切驗(yàn)證陽性克隆切出約7.2 kb、4.4 kb和2.5 kb的條帶,與理論值大小相符(圖-2B,1號和2號泳道)。將測序驗(yàn)證陽性質(zhì)粒命名為pV1093-sgMTQ2。以pFA-HA-HIS1質(zhì)粒為模版,利用引物MTQ2-Re-F和MTQ2-Re-R擴(kuò)增獲得帶有HIS1標(biāo)記的修復(fù)DNA片段大小約1.5 kb,與理論值相符(圖-2C)。將轉(zhuǎn)化后的轉(zhuǎn)化子提取基因組DNA,利用PCR的方法進(jìn)行基因型驗(yàn)證(圖3A)。通過MTQ2-Te-F和MTQ2-Te-R,在野生型菌株SN148中擴(kuò)出約1.1 kb的片段;而在雙敲除菌株中以擴(kuò)出約2 kb的片段(圖3B),MTQ2缺失株中能擴(kuò)出單一的約2 kb片段,說明MTQ2基因敲除成功。

進(jìn)一步檢測液體培養(yǎng)基中MTQ2缺失株的生長情況,結(jié)果如圖4C。液體培養(yǎng)基中MTQ2缺失株細(xì)胞形態(tài)與野生型菌株SN148相比無顯著差異,但MTQ2缺失株中較多細(xì)胞黏連成串珠狀。定量分析顯示MTQ2缺失株中3個及以上串珠狀細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的44.4%,野生型菌株為2.5%,說明MTQ2缺失影響細(xì)胞的分裂過程。圖4 白念珠菌MTQ2缺失株的表型分析


本文編號：3004201