纖維素是地球上最豐富,潛力巨大的可再生資源,微生物降解纖維素是纖維素有效利用的一種綠色環(huán)保的方法。而綠色木霉（Trichoderma viride）可以產(chǎn)生纖維素酶來(lái)降解纖維素。本研究以綠色木霉（T.viride）AS3.3711菌株為實(shí)驗(yàn)材料,根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上登錄號(hào)為EU518927的T.viride AS3.3711的eg VII基因序列來(lái)設(shè)計(jì)引物,通過(guò)DNA和RNA為模板進(jìn)行PCR,得到的序列經(jīng)過(guò)比對(duì)得出內(nèi)切葡聚糖酶VII基因沒(méi)有內(nèi)含子,基因長(zhǎng)度782 bp,開(kāi)放閱讀框750 bp,編碼249個(gè)氨基酸,理論分子量26.8002 KD,理論等電點(diǎn)7.62,信號(hào)肽是N端的19個(gè)氨基酸,屬于糖苷水解酶家族61的一種胞外酶。為高效表達(dá)內(nèi)切葡聚糖酶,將克隆到的eg VII基因連接到表達(dá)載體pPIC9K上,獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-α1-eg VII,pPIC9K-α2-eg VII和pPIC9K-α3-eg VII。將重組質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115菌株中,測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶酶活后,發(fā)現(xiàn)pPIC9K-05的酶活力最高。甲醇誘導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)化... 

【文章來(lái)源】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)黑龍江省 211工程院校

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

木質(zhì)纖維素的框架

圖 1-2 纖維素復(fù)合酶的水解機(jī)制Fig. 1-2 Hydrolysis mechanism of cellulose complex enzymes系含有的內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素降解的主要成分，它的主要作用是水[15]，在纖維素降解中至關(guān)重要。其酶活力會(huì)受到溫度、pH、激活劑和生產(chǎn)中的內(nèi)切葡聚糖酶多為具有較高的耐熱、耐酸堿性的酶，Posta葡聚糖酶，為我們提供了具有耐熱性的纖維素酶。糖酶通常由纖維素結(jié)合區(qū)域（Cellulose-binding module，CBM），main，CD）和一段富含脯氨酸或羥基氨酸的連接橋（linker）三部分組素表面并將 CD 暴露在底物之上，此時(shí) CD 呈現(xiàn)出對(duì)底物的特異性，疏解結(jié)晶纖維素的結(jié)構(gòu)[18]。達(dá)系統(tǒng)研究概況大腸桿菌已經(jīng)大范圍充當(dāng)重組蛋白表達(dá)宿主。由于這種簡(jiǎn)單的微生物修飾的機(jī)制，所以該系統(tǒng)在表達(dá)真核蛋白質(zhì)上存在問(wèn)題。因此，蛋白疊以及重組蛋白的功能特征都影響到能否在大腸桿菌中成功表達(dá)。無(wú)進(jìn)行進(jìn)一步的翻譯后修飾限制了蛋白質(zhì)表達(dá)[19]。由于在大腸桿菌中缺

圖 2-1 pPIC9K 質(zhì)粒圖譜Fig. 2-1 pPIC9K plasmid profilesEcoRI，BglII，T4DNA 連接酶，小量提取試劑盒，Trizol 試劑， Tris-HCl（pH 8.0），1 mM EDTpH 8.0）：溶解 121.1 g Tris 于 80壓滅菌。（Tris 溶液的 pH 值因溫ol/L 溶液在 5℃，25℃和 37℃時(shí)的H 8.0）：將 186.1 g EDTA-Na·2H.0，定容至 1 L，分裝后高壓滅菌


本文編號(hào)：2996605