發(fā)布時(shí)間：2017-04-11 12:23

  本文關(guān)鍵詞：維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及其基因編輯方法，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在細(xì)菌以及古細(xì)菌中廣泛存在規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)系統(tǒng),是細(xì)菌在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的由RNA介導(dǎo)降解入侵菌體的噬菌體等外源核酸的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。近年來(lái)研究表明,CRISPR系統(tǒng)可以很好地被改造成基因編輯工具。通過(guò)設(shè)計(jì)引導(dǎo)RNA招募Cas蛋白對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別切割,激活菌體內(nèi)部的同源重組(Homologous recombination, HR)修復(fù)機(jī)制,與設(shè)計(jì)好的編輯模板進(jìn)行交換以實(shí)現(xiàn)基因編輯。維吉尼亞鏈霉菌IBL14 (Streptomyces virginiae IBL14)是本實(shí)驗(yàn)室從制藥廠(chǎng)附近的活性泥污中分離得到的一株能降解多種甾體化合物的放線(xiàn)菌。本研究通過(guò)對(duì)IBL14的全基因組序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)在IBL14中也存在CRISPR系統(tǒng)。其中存在18個(gè)CRISPR位點(diǎn),其中3個(gè)是確定的位點(diǎn),其他都是有疑問(wèn)的位點(diǎn)。通過(guò)蛋白比對(duì)發(fā)現(xiàn)在SV01和SV02兩個(gè)CRISPR位點(diǎn)之間存在著一個(gè)由7個(gè)Cas蛋白基因組成的蛋白群分別是cas6, DevR (cas7),cas5,cas3, cas4,cas1,cas2。根據(jù)對(duì)casl的比對(duì)以及Cas蛋白的排列,確定了中的CRISPR系統(tǒng)屬于Ⅰ-B型并將其命名為CRISPR Ⅰ-SV14B系統(tǒng)。本研究以IBL14中svu016基因?yàn)榘谢?根據(jù)Ⅰ-B型CRISPR-Cas系統(tǒng)特點(diǎn),選取TAC堿基序列作為打靶序列PAM位點(diǎn)。選取設(shè)計(jì)一段引導(dǎo)DNA以及同源臂整合到質(zhì)粒pKC1139上,通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化到IBL14中進(jìn)行打靶,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明svu016基因成功地被敲除掉。同時(shí)另一方面利用傳統(tǒng)的敲除方式對(duì)svu016基因進(jìn)行敲除,設(shè)計(jì)帶有氯霉素抗性基因的同源臂整合到質(zhì)粒pKC1139上轉(zhuǎn)化到IBL14中,經(jīng)過(guò)大量篩選結(jié)果僅獲得一個(gè)敲除菌株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,利用CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的效率在70%以上,而傳統(tǒng)方法編輯的效率僅為3%左右。同時(shí)說(shuō)明Ⅰ-B型CRISPR-Cas系統(tǒng)可以被用來(lái)完成基因編輯,有被改造為基因編輯工具的潛能,同時(shí)編輯的效率以及準(zhǔn)確性都比傳統(tǒng)方法的要高。
【關(guān)鍵詞】：CRJSPR-Cas系統(tǒng) 維吉尼亞鏈霉菌IBL14 基因編輯
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 縮略詞表8-9
• 第一章 概述9-19
• 1.1 鏈霉菌概述9
• 1.2 CRISPR概述9-17
• 1.2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)10-11
• 1.2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)分類(lèi)11-12
• 1.2.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)免疫機(jī)理12-15
• 1.2.4 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用15-17
• 1.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)在鏈霉菌中的應(yīng)用17
• 1.4 本課題研究目的、意義及主要內(nèi)容17-19
• 第二章 維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)19-24
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料19
• 2.1.1 菌種信息19
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)中使用的本地軟件及網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-20
• 2.2.1 基因組序列獲得19
• 2.2.2 維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR位點(diǎn)預(yù)測(cè)與分析19-20
• 2.2.3 Cas蛋白的識(shí)別20
• 2.3 結(jié)果與討論20-23
• 2.3.1 IBL14全基因組測(cè)序結(jié)果20
• 2.3.2 IBL14中的CRISPR位點(diǎn)20-21
• 2.3.3 IBL14中的cas基因21-23
• 2.4 本章小結(jié)23-24
• 第三章 利用IBL14中的CRISPR I-SV14B系統(tǒng)對(duì)基因進(jìn)行編輯24-60
• 3.1 前言24
• 3.2 材料與方法24-46
• 3.2.1 菌株與質(zhì)粒24-25
• 3.2.2 主要試劑,試劑盒和試劑配制25-28
• 3.2.3 主要儀器28-29
• 3.2.4 實(shí)驗(yàn)方法29-46
• 3.3 結(jié)果與分析46-57
• 3.3.1 利用CRISPR I-SV14B系統(tǒng)對(duì)svu016基因編輯結(jié)果46-54
• 3.3.2 傳統(tǒng)方法對(duì)svu016基因編輯結(jié)果54-57
• 3.4 本章小結(jié)57-60
• 第四章 結(jié)論與展望60-62
• 4.1 結(jié)論60-61
• 4.2 展望61-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 附錄67-77
• 致謝77-78
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的文章78

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