本文關(guān)鍵詞：維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及其基因編輯方法，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：在細(xì)菌以及古細(xì)菌中廣泛存在規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR, clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)系統(tǒng),是細(xì)菌在長期進(jìn)化過程中形成的由RNA介導(dǎo)降解入侵菌體的噬菌體等外源核酸的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。近年來研究表明,CRISPR系統(tǒng)可以很好地被改造成基因編輯工具。通過設(shè)計引導(dǎo)RNA招募Cas蛋白對靶位點進(jìn)行識別切割,激活菌體內(nèi)部的同源重組(Homologous recombination, HR)修復(fù)機制,與設(shè)計好的編輯模板進(jìn)行交換以實現(xiàn)基因編輯。維吉尼亞鏈霉菌IBL14 (Streptomyces virginiae IBL14)是本實驗室從制藥廠附近的活性泥污中分離得到的一株能降解多種甾體化合物的放線菌。本研究通過對IBL14的全基因組序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)在IBL14中也存在CRISPR系統(tǒng)。其中存在18個CRISPR位點,其中3個是確定的位點,其他都是有疑問的位點。通過蛋白比對發(fā)現(xiàn)在SV01和SV02兩個CRISPR位點之間存在著一個由7個Cas蛋白基因組成的蛋白群分別是cas6, DevR (cas7),cas5,cas3, cas4,cas1,cas2。根據(jù)對casl的比對以及Cas蛋白的排列,確定了中的CRISPR系統(tǒng)屬于Ⅰ-B型并將其命名為CRISPR Ⅰ-SV14B系統(tǒng)。本研究以IBL14中svu016基因為靶基因,根據(jù)Ⅰ-B型CRISPR-Cas系統(tǒng)特點,選取TAC堿基序列作為打靶序列PAM位點。選取設(shè)計一段引導(dǎo)DNA以及同源臂整合到質(zhì)粒pKC1139上,通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法將其轉(zhuǎn)化到IBL14中進(jìn)行打靶,實驗結(jié)果表明svu016基因成功地被敲除掉。同時另一方面利用傳統(tǒng)的敲除方式對svu016基因進(jìn)行敲除,設(shè)計帶有氯霉素抗性基因的同源臂整合到質(zhì)粒pKC1139上轉(zhuǎn)化到IBL14中,經(jīng)過大量篩選結(jié)果僅獲得一個敲除菌株。實驗結(jié)果表明,利用CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的效率在70%以上,而傳統(tǒng)方法編輯的效率僅為3%左右。同時說明Ⅰ-B型CRISPR-Cas系統(tǒng)可以被用來完成基因編輯,有被改造為基因編輯工具的潛能,同時編輯的效率以及準(zhǔn)確性都比傳統(tǒng)方法的要高。
【關(guān)鍵詞】：CRJSPR-Cas系統(tǒng) 維吉尼亞鏈霉菌IBL14 基因編輯
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要3-4
• ABSTRACT4-8
• 縮略詞表8-9
• 第一章 概述9-19
• 1.1 鏈霉菌概述9
• 1.2 CRISPR概述9-17
• 1.2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)組織結(jié)構(gòu)10-11
• 1.2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)分類11-12
• 1.2.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)免疫機理12-15
• 1.2.4 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用15-17
• 1.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)在鏈霉菌中的應(yīng)用17
• 1.4 本課題研究目的、意義及主要內(nèi)容17-19
• 第二章 維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)19-24
• 2.1 實驗材料19
• 2.1.1 菌種信息19
• 2.1.2 實驗中使用的本地軟件及網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器19
• 2.2 實驗方法19-20
• 2.2.1 基因組序列獲得19
• 2.2.2 維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR位點預(yù)測與分析19-20
• 2.2.3 Cas蛋白的識別20
• 2.3 結(jié)果與討論20-23
• 2.3.1 IBL14全基因組測序結(jié)果20
• 2.3.2 IBL14中的CRISPR位點20-21
• 2.3.3 IBL14中的cas基因21-23
• 2.4 本章小結(jié)23-24
• 第三章 利用IBL14中的CRISPR I-SV14B系統(tǒng)對基因進(jìn)行編輯24-60
• 3.1 前言24
• 3.2 材料與方法24-46
• 3.2.1 菌株與質(zhì)粒24-25
• 3.2.2 主要試劑,試劑盒和試劑配制25-28
• 3.2.3 主要儀器28-29
• 3.2.4 實驗方法29-46
• 3.3 結(jié)果與分析46-57
• 3.3.1 利用CRISPR I-SV14B系統(tǒng)對svu016基因編輯結(jié)果46-54
• 3.3.2 傳統(tǒng)方法對svu016基因編輯結(jié)果54-57
• 3.4 本章小結(jié)57-60
• 第四章 結(jié)論與展望60-62
• 4.1 結(jié)論60-61
• 4.2 展望61-62
• 參考文獻(xiàn)62-67
• 附錄67-77
• 致謝77-78
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的文章78

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1 雍德祥;維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及其基因編輯方法[D];安徽大學(xué);2016年

  本文關(guān)鍵詞：維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas系統(tǒng)及其基因編輯方法，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：299119