針對轉(zhuǎn)基因玉米MON863質(zhì)粒DNA,研究建立一套雙重數(shù)字PCR（ddPCR）定值方法。優(yōu)化引物探針濃度,退火溫度等條件,考察方法特異性、線性范圍、精密度。結(jié)果表明,外源基因MON863在1.6～6 743.3 copies和內(nèi)源基因Adh在1.1～6 770.0 copies的濃度范圍均呈線性關(guān)系,r²為1;MON863基因和Adh基因的定量限分別為8.3 copies和7.9 copies;方法精密度小于5%。采用該方法對基體標(biāo)準物質(zhì)進行驗證,誤差小于10%。該方法每個反應(yīng)體系都含有內(nèi)源（VIC）和外源（FAM）基因,能實現(xiàn)內(nèi)外源基因的同時檢測,避免同一樣品在不同反應(yīng)體系造成的定值差異。結(jié)果顯示該方法與單重數(shù)字PCR定值結(jié)果無顯著差異,重復(fù)性優(yōu)于單重數(shù)字PCR結(jié)果,方法準確可靠。 

【文章來源】：中國測試. 2020,46(10)北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

引物探針終濃度優(yōu)化微滴圖

設(shè)計8個退火溫度：62,61.2,59.8,57.7,55.2,53.1,51.8,51℃，每個溫度3次平行試驗。經(jīng)考察，退火溫度為60℃（59.8℃）時，copies合適，沒有明顯的“下雨”現(xiàn)象（見圖3),RSD較�。ㄒ姳�2）。退火溫度為61.2℃時，copies雖高但有不穩(wěn)定擴增，且RSD值較高，因此，本研究選擇60℃（59.8℃）為最適退火溫度具體結(jié)果如表2、圖3和圖4所示，圖4中從左到右溫度依次為：62,61.2,59.8,57.7,55.2,53.1,51.8,51℃（每個溫度下設(shè)置3個重復(fù)）。實驗結(jié)果表明，內(nèi)源基因Adh正反向引物終濃度400 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L；外源基因MON863正反向引物終濃度250 nmol/L，探針終濃度為150 nmol/L；退火溫度為60℃時，微滴生成數(shù)達到要求，沒有明顯的“下雨”現(xiàn)象，方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性佳。

試驗表明，采用單重和雙重數(shù)字PCR方法，測得的待測質(zhì)粒DNA目標(biāo)copies無顯著差異（Adh (偏差=-0.5%)和MON863 (偏差=-5.7%)）。測得的MON863含量無顯著差異（偏差=-4.7%）（見表3）。此外，雙重數(shù)字PCR測定MON863含量的重復(fù)性優(yōu)于單重數(shù)字PCR法。經(jīng)考察，本研究建立的雙重數(shù)字PCR法與單重數(shù)字PCR法定值結(jié)果無顯著差異。2.3 定量限、檢出限、線性范圍驗證

【參考文獻】：
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