針對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米MON863質(zhì)粒DNA,研究建立一套雙重?cái)?shù)字PCR（ddPCR）定值方法。優(yōu)化引物探針濃度,退火溫度等條件,考察方法特異性、線性范圍、精密度。結(jié)果表明,外源基因MON863在1.6～6 743.3 copies和內(nèi)源基因Adh在1.1～6 770.0 copies的濃度范圍均呈線性關(guān)系,r²為1;MON863基因和Adh基因的定量限分別為8.3 copies和7.9 copies;方法精密度小于5%。采用該方法對(duì)基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證,誤差小于10%。該方法每個(gè)反應(yīng)體系都含有內(nèi)源（VIC）和外源（FAM）基因,能實(shí)現(xiàn)內(nèi)外源基因的同時(shí)檢測(cè),避免同一樣品在不同反應(yīng)體系造成的定值差異。結(jié)果顯示該方法與單重?cái)?shù)字PCR定值結(jié)果無(wú)顯著差異,重復(fù)性優(yōu)于單重?cái)?shù)字PCR結(jié)果,方法準(zhǔn)確可靠。 

【文章來(lái)源】：中國(guó)測(cè)試. 2020,46(10)北大核心

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

引物探針終濃度優(yōu)化微滴圖

設(shè)計(jì)8個(gè)退火溫度：62,61.2,59.8,57.7,55.2,53.1,51.8,51℃，每個(gè)溫度3次平行試驗(yàn)。經(jīng)考察，退火溫度為60℃（59.8℃）時(shí)，copies合適，沒有明顯的“下雨”現(xiàn)象（見圖3),RSD較�。ㄒ姳�2）。退火溫度為61.2℃時(shí)，copies雖高但有不穩(wěn)定擴(kuò)增，且RSD值較高，因此，本研究選擇60℃（59.8℃）為最適退火溫度具體結(jié)果如表2、圖3和圖4所示，圖4中從左到右溫度依次為：62,61.2,59.8,57.7,55.2,53.1,51.8,51℃（每個(gè)溫度下設(shè)置3個(gè)重復(fù)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)源基因Adh正反向引物終濃度400 nmol/L，探針終濃度為250 nmol/L；外源基因MON863正反向引物終濃度250 nmol/L，探針終濃度為150 nmol/L；退火溫度為60℃時(shí)，微滴生成數(shù)達(dá)到要求，沒有明顯的“下雨”現(xiàn)象，方法重復(fù)性好，穩(wěn)定性佳。

試驗(yàn)表明，采用單重和雙重?cái)?shù)字PCR方法，測(cè)得的待測(cè)質(zhì)粒DNA目標(biāo)copies無(wú)顯著差異（Adh (偏差=-0.5%)和MON863 (偏差=-5.7%)）。測(cè)得的MON863含量無(wú)顯著差異（偏差=-4.7%）（見表3）。此外，雙重?cái)?shù)字PCR測(cè)定MON863含量的重復(fù)性優(yōu)于單重?cái)?shù)字PCR法。經(jīng)考察，本研究建立的雙重?cái)?shù)字PCR法與單重?cái)?shù)字PCR法定值結(jié)果無(wú)顯著差異。2.3 定量限、檢出限、線性范圍驗(yàn)證

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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