接頭蛋白是一類缺乏轉(zhuǎn)錄活性和酶活性的分子,但其含有對蛋白質(zhì)結(jié)合和構(gòu)成信號復(fù)合物所需的蛋白質(zhì)間互作的結(jié)構(gòu)域。SKAP1和FYB1是一對主要在T細(xì)胞和免疫細(xì)胞中表達(dá)的功能相關(guān)的接頭蛋白,并且FYN-SKAP1分子模塊在“inside-out”信號通路中作為整合素激活的調(diào)控因子來介導(dǎo)T細(xì)胞粘附。FYB1結(jié)合并維持SKAP1的表達(dá),在細(xì)胞系和動物模型中,FYB1的敲除會導(dǎo)致SKAP1蛋白的顯著性降解。在由整合素激活而引起的T細(xì)胞粘附中FYB1和SKAP1的功能性存在很大的重疊性,Fyb和Skap1單基因敲除的小鼠已經(jīng)產(chǎn)生并廣泛應(yīng)用于研究,Fyb和Skap1雙基因敲除小鼠有利于對FYB-SKAP1分子模塊在TCR介導(dǎo)的整合素激活進(jìn)行功能性評估,但Fyb和Skap1雙基因敲除小鼠還未有報導(dǎo)。本研究的主要目標(biāo)是利用Fyb和Skap1單基因敲除的小鼠進(jìn)行一系列的交配,最終培育出Skap1和Fyb的雙基因敲除小鼠模型。此外,為鑒定與SKAP1互作的分子,使用免疫共沉淀法得到Jurkat細(xì)胞中與SKAP1結(jié)合的蛋白,再使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行分析。結(jié)果:獲得了基因型能穩(wěn)定遺傳的Fyb和Skap1雙基因敲... 

【文章來源】：浙江農(nóng)林大學(xué)浙江省

【文章頁數(shù)】：50 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

人FYB1蛋白的結(jié)構(gòu)域及特殊位點Figure1.1ThedomainsandspecialaminoacidsitesofhumanFYB1protein

SKAP1 的蛋白大小為 55 kDa，SKAP1 蛋白存在兩個變體，變體 1 編碼 359 個氨基酸，變體 2 編碼 358 個氨基酸，雖相差 1 個氨基酸但兩個變體均具有相同的氨基端與羧基端。人 SKAP1 蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖如下（圖 1.2），氨基端區(qū)域含有一個特殊的PH 結(jié)構(gòu)域（aa107-210），羧基端有一個 SH3 結(jié)構(gòu)域（aa294-355）[42]，共有五個能被磷酸化的酪氨酸位點，分別為 aa142，aa219，aa232，aa271，aa295，其中 aa271 和aa295 的酪氨酸位點能被 FYN 蛋白磷酸化，aa232 的酪氨酸位點能被 PTPRC 蛋白（Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C）磷酸化[43]。SKAP1 蛋白的 290 位到 295位氨基酸與 FYB1 蛋白發(fā)生結(jié)合，SKAP1 蛋白的 aa271 被 FYN 蛋白磷酸化是 SKAP1蛋白與 Grb2 蛋白結(jié)合的先決條件[44]，當(dāng) aa295 被 FYN 磷酸化后會使 SKAP1 與 FYB1的結(jié)合功能喪失[41, 45]。在未被激活 T 細(xì)胞中，SKAP1 蛋白 120 位的天冬氨酸可使SKAP1 蛋白滯留在細(xì)胞質(zhì)中，而 TCR 被激活后，SKAP1 蛋白 152 位的賴氨酸能通過結(jié)合肌動蛋白（actin）來促進(jìn) SKAP1 細(xì)胞膜招募的功能[46]。SKAP1 蛋白的 D120 與K152 均位于 PH 結(jié)構(gòu)域內(nèi)，PH 結(jié)構(gòu)域與肌動蛋白的結(jié)合依賴于 K152，且該結(jié)合能促進(jìn)裸蛋白（talin）與 LFA-1 的結(jié)合，最終使 LFA-1 被激活[46]。

圖 2.1 Fyb 和 Skap1 雙基因敲除小鼠的配種Figure 2.1 The breeding of Fyb and Skap1 double knockout mice小鼠基因表達(dá)的鑒定 小鼠脾臟細(xì)胞的獲取. 左手拇指與大拇指按住小鼠頸椎處，右手拉住小鼠尾巴，拉斷小鼠頸椎，鼠浸泡于 70 %的乙醇消毒 10 min。. 瀝干小鼠，并將小鼠的四肢固定于解剖板，腹部朝上。用鑷子提起腹中線殖器的皮膚，用剪刀沿腹中線由尾部向頭部剪開皮膚，不要剪破腹膜，再按剪開皮膚，并固定皮膚，暴露腹腔的左部。. 準(zhǔn)備好一個 6 cm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿，70 μm 的細(xì)胞濾網(wǎng)，將細(xì)胞濾網(wǎng)置于細(xì)胞。. 換一副新的鑷子和剪刀，剪開腹膜，用鑷子夾起胃并提起，即可看到呈深條狀的脾臟。將脾臟取出并放于事先準(zhǔn)備好的細(xì)胞濾網(wǎng)中，向脾臟加 3 m. 用研磨器研磨脾臟至肉眼不可見塊狀的組織，將細(xì)胞濾網(wǎng)置于 50 ml 離心


本文編號：2974620