胃癌是最常見的腫瘤之一,其發(fā)病率和死亡率在全球居于第五和第三,中國也是胃癌大國,僅次于肺癌。目前用于胃癌研究的小鼠原發(fā)性腫瘤模型造模時(shí)間長,成功率低。隨著CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在腫瘤造模中的廣泛應(yīng)用,針對肺癌、肝癌等的小鼠原發(fā)腫瘤模型可以快速、高效建立,幫助揭示了不同類型腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,但基于CRISPR技術(shù)的小鼠原發(fā)性胃癌模型未見報(bào)導(dǎo)。本研究將34個(gè)抑癌基因的sg RNA文庫以及Cas9基因通過胃黏膜高壓注射導(dǎo)入胃部細(xì)胞,利用CRISPR/Cas9技術(shù)體內(nèi)編輯抑癌基因,大約7周內(nèi)誘導(dǎo)了胃癌的形成;利用免疫組化和PCR靶向擴(kuò)增子二代測序等技術(shù)和方法,分析腫瘤結(jié)節(jié)、對應(yīng)的癌旁組織、腫瘤原代細(xì)胞及單克隆,構(gòu)建其抑癌基因編輯突變圖譜,發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中胃癌常見的抑癌基因發(fā)生了高頻率的突變,包括p53,Arid1a,Apc,Smad4,Pten等。根據(jù)突變圖譜,進(jìn)一步從34個(gè)抑癌基因sg RNA文庫中選出12個(gè)sg RNA組裝成一個(gè)小文庫,這個(gè)小文庫也能在3個(gè)月內(nèi)成功誘導(dǎo)胃部腫瘤的形成,其中p53、Arid1b、Smad4和Pten也發(fā)生了高頻突變,特別是在兩個(gè)不同文庫誘導(dǎo)成... 

【文章來源】：浙江大學(xué)浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：81 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

靶向抑癌基因文庫信息

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文正文結(jié)果26圖2CRISPR技術(shù)成功誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生胃癌（A.實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠胃部解剖大體觀圖，5-8號小鼠為對照組小鼠（綠色文本），9-12號小鼠為實(shí)驗(yàn)組小鼠（紅色文本）；B.實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠胃黏膜高壓注射后體重變化折線圖；C.實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠胃部腫瘤體積（1/2和腫瘤寬度2×腫瘤長度）差異圖；D.腫瘤

浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文正文結(jié)果28圖3CRISPR誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生胃癌的免疫組化結(jié)果3.4胃癌靶向基因編輯圖譜本研究通過對產(chǎn)生腫瘤的癌旁組織，腫瘤組織和對應(yīng)的原代細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增子二代深度測序來分析靶向位點(diǎn)的編輯情況，為了避免測序誤差的影響，本研究排除了基因編輯位點(diǎn)的編輯頻率小于5%的情況�？偣矞y序12個(gè)樣本，其中4個(gè)癌旁組織，4個(gè)腫瘤組織和對應(yīng)的原代腫瘤細(xì)胞（圖4A）。就9號小鼠所產(chǎn)生的癌旁組織（NT9）,腫瘤組織（T9）和原代細(xì)胞（C9）而言（圖4B），發(fā)生靶向編輯的個(gè)數(shù)占總位點(diǎn)的個(gè)數(shù)的比率分別為5.9%（2/34），82.35%（28/34）和79.41%（27/34）。樣本NT9的Arid1b（100%）和Mlh1（21.95%）發(fā)生了編輯；T9除Apc、Atm、Axin1、Chd1、Fbxw7和Rps6ka3未發(fā)生編輯外，其余位點(diǎn)均


本文編號：2968747