目的人神經(jīng)系統(tǒng)中尤為重要的轉(zhuǎn)錄因子Purα,是體內(nèi)一個重要的轉(zhuǎn)錄因子,不只在神經(jīng)系統(tǒng),在體內(nèi)的許多環(huán)節(jié)中都有很重要的作用,它與神經(jīng)元的發(fā)育,突觸形成都有很密切的關(guān)系。本文通過建立Purα基因敲除的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系來觀察其在DNA損傷修復(fù)中的作用。方法1)CRISPR/Cas9基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建以及鑒定:依據(jù)目的基因靶向去除外顯子的位置來設(shè)計相對應(yīng)的sgRNA序列,合成相應(yīng)的寡核苷酸后克隆在pSpCas9（BB）-2A-Puro（pX459）V2.0質(zhì)粒載體相對應(yīng)的位點上,挑選陽性克隆進行酶切和測序鑒定;2)穩(wěn)定細(xì)胞系的建立及鑒定:將克隆好的CRISPR/Cas9-Purα質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠海馬神經(jīng)元（HT22）細(xì)胞中,加入嘌呤霉素進行抗性篩選,保留正常生長的細(xì)胞進行培養(yǎng),運用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平以了解Purα基因的表達(dá)情況;3)Purα在DNA損傷修復(fù)中的作用:分別用羥基脲（HU）處理細(xì)胞,通過Western blot、脈沖電場反轉(zhuǎn)凝膠電泳實驗及細(xì)胞毒性實驗觀察Purα在DNA損傷修復(fù)中的作用。結(jié)果測序的結(jié)果證實所插入片段相位正確... 

【文章來源】：寧夏醫(yī)科大學(xué)寧夏回族自治區(qū)

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一部分 ：應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Purα基因敲除質(zhì)粒及細(xì)胞系
    前言
    材料
    方法
    實驗結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻（References）
第二部分 ：Purα在DNA損傷與修復(fù)中的研究
    前言
    方法
    實驗結(jié)果
    討論
    結(jié)論
    參考文獻（References）
綜述
    參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄
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本文編號：2965719