結(jié)腸癌的發(fā)病率和致死率居高不下,嚴(yán)重危害我國(guó)人民的生命健康,為社會(huì)保障制度造成嚴(yán)重負(fù)擔(dān)�；熓沁M(jìn)展期的結(jié)腸癌尤其是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的主要治療方法,目前仍基于伊立替康或奧沙利鉑結(jié)合氟尿嘧啶/亞葉酸等小分子藥物治療方式,平均生存期僅有18個(gè)月。BRAF作為絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）途徑的重要一環(huán),是人類(lèi)最重要的原癌基因之一,調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化、遷移、存活和血管生成。BRAF基因突變所致的結(jié)腸癌在進(jìn)展期結(jié)腸癌中約占10%,其化療效果較差,缺乏最佳治療方案,整體生存期顯著少于BRAF基因未突變患者,且化療后的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移成為患者死亡的主要原因,是目前結(jié)腸癌化療的面臨的主要挑戰(zhàn)之一。雖然BRAF靶向抑制劑在BRAF基因突變的結(jié)腸癌患者治療的初期可取得較好的療效,但是在治療后期MAPK信號(hào)通路的再活化可導(dǎo)致進(jìn)一步的耐藥和不良預(yù)后。因此,深入研究和探討B(tài)RAF基因突變所致化療耐藥的相關(guān)靶點(diǎn)和分子機(jī)制,并篩選相關(guān)靶向干預(yù)藥物,有望實(shí)現(xiàn)對(duì)該類(lèi)結(jié)腸癌亞型患者精準(zhǔn)有效治療,并將有效提高BRAF基因突變結(jié)腸癌患者的生存期。研究表明轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中絕大多數(shù)BRAF基因突變所致是由于600位密碼子A和T發(fā)... 

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不同濃度氟尿嘧啶處理對(duì)BRAF野生型或突變型細(xì)胞活性及死亡影響

第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果23圖3.2氟尿嘧啶處理對(duì)BRAF野生型或突變型細(xì)胞凋亡的影響及定量A．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)氟尿嘧啶在5μg/ml和10μg/ml處理BRAF野生型或突變型細(xì)胞24h的細(xì)胞凋亡情況；B．利用Graphpad6.0軟件對(duì)圖A進(jìn)行定量并繪制細(xì)胞凋亡率柱狀圖。*P<0.05(Student’st-test,twotailed).WTvsMut.3.2BRAF基因V600E突變能顯著增強(qiáng)氟尿嘧啶引起的線(xiàn)粒體凋亡明確細(xì)胞凋亡在BRAF基因V600E突變對(duì)氟尿嘧啶的重要作用后，探究線(xiàn)粒體凋亡對(duì)該過(guò)程中扮演的角色。線(xiàn)粒體凋亡通路即內(nèi)在凋亡通路可以對(duì)存活因子、細(xì)胞應(yīng)激和損傷等細(xì)胞信號(hào)最先做出響應(yīng)，顧名思義該通路的核心就是線(xiàn)粒體，線(xiàn)粒體的褶皺內(nèi)膜間隙貯存多種促凋亡因子，這些因子一旦釋放，就會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡。線(xiàn)粒體外膜透化取決于促凋亡的Bax/Bak蛋白與抗凋亡蛋白的Bcl2/Bcl-xL之間的平衡，每個(gè)BH3成員都充當(dāng)不同信號(hào)通路的末端效應(yīng)子對(duì)這些蛋白的活性進(jìn)行正向或負(fù)向調(diào)節(jié)[79-81]。3.2.1BRAF基因V600E突變對(duì)氟尿嘧啶引起的凋亡通路caspase表達(dá)的影響為探索氟尿嘧啶作用于BRAF突變型結(jié)腸癌細(xì)胞的敏感性的分子機(jī)制，利用WesternBlot分子生物學(xué)方法檢測(cè)凋亡通路執(zhí)行者CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8、CleavedCaspase-9蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟尿嘧啶在BRAF突變型和野生型細(xì)胞中引起一定程度的Caspase-3和Caspase-9裂解，而并未引起Caspase-8裂解（圖3.3A）。經(jīng)過(guò)裂解帶灰度值統(tǒng)計(jì)結(jié)果，突變型和野生型結(jié)腸癌細(xì)胞中Caspase-3和Caspase-9激活程度不同，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3.3B）。由此可見(jiàn)Caspase-3是由Caspase-9激活，而并非Caspase-8。因此，我們可以得出結(jié)論

第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果24氟尿嘧啶對(duì)BRAF突變型細(xì)胞凋亡是通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑實(shí)現(xiàn)，也是由于線(xiàn)粒體凋亡通路激活程度不同導(dǎo)致對(duì)氟尿嘧啶的敏感性差異的結(jié)果。而后，我們將著眼于Caspase-3/-9上游通路研究。圖3.3BRAF基因V600E突變對(duì)氟尿嘧啶引起的凋亡通路caspase表達(dá)的影響A.WesternBlot分子生物學(xué)方法檢測(cè)凋亡通路執(zhí)行者CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8、CleavedCaspase-9蛋白表達(dá)水平；B-D.利用Graphpad6.0軟件對(duì)CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8、CleavedCaspase-9表達(dá)水平進(jìn)行定量并繪制相應(yīng)柱狀圖。*P<0.05(Student’st-test,twotailed).WTvsMut.


本文編號(hào)：2961955