大豆（Glycine max（Linn.）Merr.）是我國重要的糧食經(jīng)濟(jì)作物,大豆皂苷是大豆中一類重要的次生代謝產(chǎn)物,對植物生命活動(dòng)具有重要作用,在保健品和化工產(chǎn)業(yè)具有巨大的市場潛力。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGR）是大豆皂苷合成代謝途徑上游的第一個(gè)關(guān)鍵酶,且以基因家族的形式存在,決定著最終大豆皂苷合成的含量。因此,研究大豆HMGR基因家族對于深入探究大豆皂苷合成代謝機(jī)制具有重要意義。本研究以武鄉(xiāng)小黑豆為供試材料,克隆大豆HMGR關(guān)鍵酶基因家族,并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。采用熒光定量PCR技術(shù)對武鄉(xiāng)小黑豆及晉遺30苗期根、莖、葉不同組織及籽粒不同發(fā)育時(shí)期中HMGR基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測分析,進(jìn)而在HMGR基因轉(zhuǎn)錄水平上揭示該基因家族的分子調(diào)控機(jī)制。將8個(gè)GmHMGR基因分別轉(zhuǎn)進(jìn)了INVScⅠ釀酒酵母,利用半乳糖誘導(dǎo)進(jìn)行過表達(dá),在不同濃度的H₂O₂和NaCl脅迫條件下,觀察轉(zhuǎn)基因酵母的生長狀況,分析其抗氧化和抗鹽能力,初步探究大豆HMGR基因家族的功能。主要研究結(jié)果如下:1.克隆分離得到8個(gè)GmHMGR基因。cDNA全長為42... 

【文章來源】： 刁秀楠 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)

【文章頁數(shù)】：58 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pEASY-Blunt載體圖譜

122.2.9測序?qū)⑻崛〉闹亟M質(zhì)粒送往上海生工生物股份有限公司，利用通用引物M13F/M13R測序，得到測序正確的基因序列。2.2.10GmHMGR基因家族生物信息學(xué)分析利用MG2C2.0（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）繪制染色體定位圖。理化性質(zhì)利用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）來預(yù)測，SOPMA（http://bip.weizmann.ac.il/biotools/faq.html）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。Phyre2（http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html）分析其三級(jí)結(jié)構(gòu)。利用Clustalw程序?qū)mHMGR基因編碼蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，用MEGA5.0軟件利用鄰接法（Neighbor-Joiningalgorithm）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。MEME（http://memesuite.org/）分析保守結(jié)構(gòu)域，GSDS2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析基因結(jié)構(gòu)，用TMHMM-2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行跨膜螺旋結(jié)構(gòu)預(yù)測。WoLFPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位。SignalP4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）對蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測。PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子分析。2.3結(jié)果與分析2.3.1總RNA的提取由圖2-2可知，所提大豆總RNA電泳時(shí)，位于4.6~5.3kb的28SrRNA和1.8~2.0kb的18SrRNA條帶清晰完整，且亮度達(dá)到2:1，泳道無拖尾現(xiàn)象，說明所提武黑的總RNA完整性較好。使用核酸蛋白檢測儀檢測濃度及純度，A260/A280值為2.0以上，A260/A230值為2.0以上，說明所提RNA純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。圖2-2武黑苗期不同組織總RNA電泳圖Fig.2-2ElectrophoresisoftotalRNAofdifferenttissuesatseedlingstageinWuhei注：M:Trans1KMark；1：根；2：莖；3：葉。Note:M:Trans1KMark;1:Root;2:Stem;3:Leaf.

132.3.2基因的克隆及測序由于本實(shí)驗(yàn)室前期已克隆出1個(gè)GmHMGR基因，將其命名為GmHMGR1。將鑒定的其余7個(gè)GmHMGR基因家族的成員，根據(jù)GmHMGR基因基因家族各成員序列特異性設(shè)計(jì)基因特異引物并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆測序得到了全部的基因序列，結(jié)果如圖2-3、圖2-4、表2-6。GmHMGR1~GmHMGR8基因cDNA全長分別為1842bp、426bp、1976bp、2069bp、1990bp、2135bp、1825bp、1861bp，開放閱讀框長度分別為1632bp、243bp、1668bp、1782bp、1827bp、1764bp、1671bp、1698bp，分別編碼543、80、555、593、608、587、556、565個(gè)氨基酸。該基因家族的克隆產(chǎn)物將被用于后續(xù)的表達(dá)載體構(gòu)建和功能驗(yàn)證。圖2-3GmHMGR基因克隆電泳圖Fig.2-3ElectrophoresisofclonedGmHMGRgenes注：M:Trans5KMark；1~8分別為GmHMGR1~GmHMGR8。Note:M:Trans5KMark;1~8areGmHMGR1~GmHMGR8.表2-6GmHMGR基因的克隆片段Table2-6ClonedsequenceofGmHMGRgenes基因名稱Genename基因IDGeneID基因全長Genelength(bp)5"-非翻譯區(qū)5"-UTR(bp)3"-非翻譯區(qū)3"-UTR(bp)開放閱讀框ORF(bp)編碼蛋白長度Proteinslength(aa)GmHMGR1XM_003517069.41842801301632543GmHMGR2XM_014775260.24261325124380GmHMGR3XM_003537651.31976362721668555GmHMGR4XM_003534178.420691081791782593GmHMGR5XM_006605513.31990126371827608GmHMGR6XM_003547838.421352701011764587GmHMGR7XM_003519426.4182558961671556GmHMGR8XM_003545508.4186191721698565


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