牛支原體（Mycoplasma bovis,M.b）是牛（Bos taurus）的一種重要致病性支原體,感染后可引起牛多種疾病。丙酮酸脫氫酶復合體E1（pyruvate dehydrogenase E1,PDHc E1）是參與生物體糖代謝過程的一個限速酶,廣泛存在于微生物、哺乳動物及高等植物中,其直接影響丙酮酸向乙酰輔酶A的轉化。本研究參照Gen Bank中M.b PG45株的PDHc E1α亞基基因pdhα和PDHc E1β亞基基因pdhβ序列設計引物,通過PCR擴增獲得M.b武威株的pdhα（Gen Bank登錄號:KU355295）及pdhβ基因（Gen Bank登錄號:KU355296）,在序列測定的基礎上應用重疊延伸PCR（Overlap PCR）技術完成基因優(yōu)化并構建原核表達質粒p ET-pdhα和p ET-pdhβ。表達質粒分別轉化大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）后經異丙基硫代半乳糖苷（isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）誘導表達重組PDHc E1α亞基融合蛋白PDHA及PDHc E1β亞基蛋白... 

【文章來源】：農業(yè)生物技術學報. 2016年04期 北大核心

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

1α和E1β亞基在牛支原體細胞膜和細胞質中分布

亞細胞定位鑒定相類似，故定位于牛支原體細胞膜的E1α和E1β亞基是否具有與其他支原體及病原菌外向酶相似的生物學功能，如粘附、入侵、免疫逃逸、圖9E1α和E1β亞基在牛支原體細胞膜和細胞質中分布的ELISA分析Figure9ELISAanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.b空白Blankcontrolα-亞基抗血清Anti-PDHAβ-亞基抗血清Anti-PDHB00.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50膜蛋白Membraneprotein胞漿蛋白CytosolproteinDO504圖7重組融合蛋白rPDHA和rPDHB的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinsrPDHAandrPDHBM：預染蛋白分子質量標準；1：pET-pdhα表達菌超聲裂解沉淀；2：pET-pdhα表達菌超聲裂解上清；3：rPDHA純化產物；4：pET-pdhβ表達菌超聲裂解沉淀；5：pET-pdhβ表達菌超聲裂解上清；6：rPDHB純化產物；7：pET-28a(+)轉化的表達菌。M:Prestainedproteinladder;1:Lyticprecipitationofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;2:Lyticsupernatantofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;3:PurifiedrPDHA;4:Lyticpre-cipitationofexpressionproductsfrompET-pdhβ;5:Lyticsu-pernatantofexpressionproductsfrompET-pdhβ;6:PurifiedrPDHB;7:NegativecontrolM12345675341302218149kD4037kD圖8E1α和E1β亞基在牛支原體細胞膜和細胞質中分布的Westernblot分析Figure8WesternblotanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.bM：預染蛋白分子標準；A1：rPDHA；B1：rPDHB；A2、B2：全菌蛋白；A3、B3：疏水性蛋白；A4、B4：親水性蛋白M:Prestainedproteinladder;A1

ㄎ煌ǔ？煞治??餉浮??內酶及共價鍵連接在細胞表面的外向酶等，而外向酶的功能是目前細菌學研究的熱點。Thomas等(2013)等對肺炎支原體的研究表明，肺炎支原體E1β是一種血纖維蛋白溶酶原結合相關蛋白，并且E1β被遞呈在肺炎支原體的細胞膜上；而Dallo等(2002)證明肺炎支原體的E1β同樣被轉運至細胞膜表面，并結合纖連蛋白進行感染。這與本研究的亞細胞定位鑒定相類似，故定位于牛支原體細胞膜的E1α和E1β亞基是否具有與其他支原體及病原菌外向酶相似的生物學功能，如粘附、入侵、免疫逃逸、圖9E1α和E1β亞基在牛支原體細胞膜和細胞質中分布的ELISA分析Figure9ELISAanalysisofdistributionofE1αandE1βsubunitsinthemembraneandcytoplasmfromM.b空白Blankcontrolα-亞基抗血清Anti-PDHAβ-亞基抗血清Anti-PDHB00.050.100.150.200.250.300.350.400.450.50膜蛋白Membraneprotein胞漿蛋白CytosolproteinDO504圖7重組融合蛋白rPDHA和rPDHB的SDS-PAGE分析Figure7SDS-PAGEanalysisofrecombinantproteinsrPDHAandrPDHBM：預染蛋白分子質量標準；1：pET-pdhα表達菌超聲裂解沉淀；2：pET-pdhα表達菌超聲裂解上清；3：rPDHA純化產物；4：pET-pdhβ表達菌超聲裂解沉淀；5：pET-pdhβ表達菌超聲裂解上清；6：rPDHB純化產物；7：pET-28a(+)轉化的表達菌。M:Prestainedproteinladder;1:Lyticprecipitationofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;2:Lyticsupernatantofexpres-sionproductsfrompET-pdhα;3:PurifiedrPDHA;4:Lyticpre-cipitationofexpressionproductsfrompET-pdhβ;5:Lyticsu-pernatantofexpressionproductsfrompET-pdhβ;6:PurifiedrPDHB;7:NegativecontrolM

【參考文獻】：
期刊論文
[1]綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae）丙酮酸脫氫酶E1-α亞單位基因（pdha）的克隆、表達及其免疫學活性測定[J]. 許健,儲岳峰,高鵬程,趙萍,賀英,剡根強,逯忠新.  農業(yè)生物技術學報. 2012(03)
[2]國內首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[J]. 辛九慶,李媛,郭丹,宋念華,胡守萍,陳超,裴潔,曹培麗.  中國預防獸醫(yī)學報. 2008(09)



本文編號：2952982