海藻糖分子是由兩個葡糖基以a-1,1糖苷鍵連接而成,具有優(yōu)良的生物學(xué)性能和食品加工性能,其被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)等領(lǐng)域。本實驗中,我們對耐壓耐冷沉積微桿菌Microbacterium sediminis YLB-01的重組6-磷酸海藻糖合成酶（msTPS）和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶（msTPP）的性質(zhì)進行了一系列的研究。msTPS和msTPP預(yù)測分子量分別為55.15kDa和28.59kDa,理論等電點分別為5.89和4.59。我們首先以Microbacterium sediminis YLB-01的TPS和TPP編碼基因為依據(jù),分別克隆目的基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒并將其導(dǎo)入到表達宿主菌體內(nèi)進行誘導(dǎo)表達,然后通過Ni2+親和層析、透析及超濾獲得較純濃縮蛋白收集液,最后通過相關(guān)實驗對其酶學(xué)性質(zhì)做了探究。研究表明：（1）重組-nsTPS最適反應(yīng)溫度和pH分別為40℃和7.5,4℃時依然具有較高的活性,熱穩(wěn)定性較差,Mg2+Co2+或Ba2+能極大的促進其活性,Mn2+、Zn2+、Ca2+和Hg2+對活性沒有影響,在本實驗條件下對6-磷酸葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖的Km值分別為1.38mM和1.53mM... 

【文章來源】：福建農(nóng)林大學(xué)福建省

【文章頁數(shù)】：98 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 海藻糖的研究現(xiàn)狀概述
        1.1.1 海藻糖的理化性質(zhì)
        1.1.2 海藻糖在食品加工中的應(yīng)用
        1.1.3 海藻糖的生產(chǎn)制備
    1.2 6-磷酸海藻糖合成酶研究概述
    1.3 6-磷酸海藻糖磷酸酯酶研究概述
    1.4 msTPS基因生物信息學(xué)分析
    1.5 msTPP基因生物信息學(xué)分析
    1.6 酶促反應(yīng)動力學(xué)
        1.6.1 底物濃度對酶反應(yīng)速度的影響
m">        1.6.2 米氏常數(shù)Km

        1.6.3 雙倒數(shù)作圖法測定K_m和V_max的值
    1.7 研究意義及內(nèi)容
        1.7.1 研究意義
        1.7.2 研究內(nèi)容
第二章 TPS編碼基因的克隆、表達及其酶學(xué)性質(zhì)研究
    2.1 實驗材料與儀器
        2.1.1 菌株與質(zhì)粒
        2.1.2 試劑與工具酶
        2.1.3 主要儀器
    2.2 實驗方法
        2.2.1 培養(yǎng)基和部分溶液的配置
        2.2.2 菌株在低溫、高壓條件下的培養(yǎng)
        2.2.3 基因組DNA提取
        2.2.4 msTPS編碼基因擴增
        2.2.5 PCR產(chǎn)物的純化
        2.2.6 載體pET-28a（+）的線性化
        2.2.7 PCR產(chǎn)物與載體pET-28a（+）連接
        2.2.8 E.coli DH5α及E.coli BL21感受態(tài)細胞的制備
        2.2.9 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與陽性克隆子的篩選
        2.2.10 重組菌株構(gòu)建與蛋白誘導(dǎo)表達
        2.2.11 重組msTPS的分離純化
        2.2.12 重組msTPS酶活測定方法
        2.2.13 重組msTPS酶學(xué)性質(zhì)研究
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 基因組DNA的提取
        2.3.2 TPS編碼基因的擴增
        2.3.3 PCR產(chǎn)物測序驗證及純化
        2.3.4 載體pET-28a（+）的線性化
        2.3.5 重組質(zhì)粒TPS@pET-28a的構(gòu)建
        2.3.6 重組msTPS誘導(dǎo)表達及純化
        2.3.7 蛋白定量及重組菌株的酶表達量
        2.3.8 重組msTPS酶學(xué)性質(zhì)研究
    2.4 本章小結(jié)
第三章 TPP編碼基因的克隆、表達及其酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.1 實驗材料與儀器
        3.1.1 菌株與質(zhì)粒
        3.1.2 試劑與工具酶
        3.1.3 主要儀器
    3.2 實驗方法
        3.2.1 培養(yǎng)基和部分溶液的配置
        3.2.2 菌株在低溫、高壓條件下的培養(yǎng)
        3.2.3 基因組DNA提取
        3.2.4 msTPP編碼基因的擴增
        3.2.5 PCR產(chǎn)物的純化
        3.2.6 載體pET-28a（+）的線性化
        3.2.7 PCR產(chǎn)物與載體pET-28a（+）的連接
        3.2.8 E.coli DH5α及E.coli BL21感受態(tài)細胞的制備
        3.2.9 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化與陽性克隆子的篩選
        3.2.10 重組菌株構(gòu)建與蛋白誘導(dǎo)表達
        3.2.11 重組msTPP的分離純化
        3.2.12 重組msTPP酶活測定
        3.2.13 重組msTPP酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 基因組DNA的提取
        3.3.2 msTPP編碼基因的擴增
        3.3.3 PCR產(chǎn)物驗證及純化
        3.3.4 載體pET-28a（+）的線性化
        3.3.5 重組質(zhì)粒TPP@pET-28a的構(gòu)建
        3.3.6 重組msTPP誘導(dǎo)表達及純化
        3.3.7 蛋白定量及重組菌株的酶表達量
        3.3.8 重組msTPP酶學(xué)性質(zhì)研究
    3.4 本章小結(jié)
第四章 總結(jié)與展望
    4.1 總結(jié)
    4.2 展望
參考文獻
致謝
附件
    附件1：msTPS編碼基因序列
    附件2：msTPS氨基酸序列
    附件3：msTPP編碼基因序列
    附件4：msTPP氨基酸序列


【參考文獻】：
期刊論文
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[4]海藻糖的加工性能及在食品行業(yè)中的應(yīng)用[J]. 劉紅梅.  輕工科技. 2013(08)
[5]海藻糖在焙烤食品中應(yīng)用研究進展[J]. 王乃強,周清濤,帥斌,王彬彬,楊海軍.  食品安全導(dǎo)刊. 2013(05)
[6]響應(yīng)面法優(yōu)化食尼古丁節(jié)桿菌發(fā)酵產(chǎn)海藻糖合成酶的工藝[J]. 張良,肖勇生,包珍,湯峰,劉媛潔,郭德斌.  安徽農(nóng)業(yè)科學(xué). 2012(32)
[7]麥芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表達及遺傳穩(wěn)定性[J]. 茍興華,王衛(wèi),劉達玉,郭秀蘭,張佳敏,唐仁勇,李德華,胡海洋.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報. 2010(03)
[8]海藻糖在冷凍豬肉中的應(yīng)用研究[J]. 李勤,彭亞鋒,周家春,薛峰.  食品工業(yè)科技. 2009(01)
[9]海藻糖TPS/TPP生物合成途徑的進化研究[J]. 楊艷,李增波.  科技情報開發(fā)與經(jīng)濟. 2008(16)
[10]海藻糖酶法合成途徑及其酶基因的重組表達研究[J]. 李鐳,丁宏標(biāo),余曉斌,喬宇.  生物技術(shù)通報. 2007(03)

碩士論文
[1]海藻糖合酶高產(chǎn)菌株的選育及酶學(xué)特性研究[D]. 丁振.山東輕工業(yè)學(xué)院 2007



本文編號：2943383

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