水稻是世界上最重要的糧食作物之一,雜交稻的培育是提高水稻產(chǎn)量的重要方法,現(xiàn)如今最有效的方法是選育兩用核不育系來(lái)配組雜交稻組合,但由于兩用核不育系的選用受到多方面的限制,至今為止還沒(méi)有一條特別有效的選育路徑。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)是繼鋅指核酸酶（ZFNs）、類轉(zhuǎn)錄因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）和巨核酶技術(shù)的另一種基因編輯技術(shù),它具有打靶效率高、周期短、載體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單等特點(diǎn),為定向改良目標(biāo)基因提供了一條非常有效的基因突變技術(shù)手段。隨著水稻功能基因組研究的可喜進(jìn)展,克隆了一批控制光溫敏核不育性狀的基因,為開(kāi)展基因定向突變打好了非常好的基礎(chǔ)。本研究選擇水稻隱性光溫敏不育基因PTGMS2-1利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行定向突變來(lái)獲得水稻光溫敏核不育系,開(kāi)展了如下研究并獲得如下結(jié)果:1、構(gòu)建了CRISPR/Cas9定向突變載體:通過(guò)分析PTGMS2-1基因序列,在外顯子上選出以A開(kāi)頭NGG結(jié)尾和G開(kāi)頭NGG結(jié)尾的20個(gè)堿基的目標(biāo)序列,其中以A開(kāi)頭的目標(biāo)序列與含有U3啟動(dòng)子的雙元載體相連,以G開(kāi)頭的目標(biāo)序列與含有U6啟動(dòng)子的雙元載體相連。利用大腸桿菌的轉(zhuǎn)化方法篩選出目標(biāo)載體,... 

【文章來(lái)源】：江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省

【文章頁(yè)數(shù)】：53 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1 光溫敏不育系的研究進(jìn)展
        1.1 光照和溫度對(duì)兩用核不育系育性的影響
        1.2 光溫敏核不育系的分類
        1.3 兩用核不育系選育的途徑與方法
        1.4 兩用核不育系基因的定位與克隆
        1.5 兩用核不育系選育存在的問(wèn)題
    2 CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展
        2.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)
        2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的防御機(jī)制
        2.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與類型
        2.4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因編輯
        2.5 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中的研究進(jìn)展
        2.6 CRISPR/Cas9系統(tǒng)面臨的挑戰(zhàn)和未來(lái)的發(fā)展
    3 本研究的目的和意義
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    1 實(shí)驗(yàn)材料
    2 主要的試劑及引物
        2.1 主要的試劑
        2.2 主要的引物序列
    3 載體的構(gòu)建
        3.1 目標(biāo)序列的設(shè)計(jì)
        3.2 連接反應(yīng)
        3.3 大腸桿菌轉(zhuǎn)化
        3.4 單克隆菌種的挑取與保存
        3.5 質(zhì)粒的提取及檢測(cè)
        3.6 酶切反應(yīng)體系
        3.7 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化
    4 CRISPR/Cas9的載體遺傳轉(zhuǎn)化
        4.1 粵泰B愈傷組織的誘導(dǎo)
        4.2 共培養(yǎng)菌液的制備
        4.3 共培養(yǎng)和共培養(yǎng)后愈傷的篩選
        4.4 愈傷組織的分化培養(yǎng)
    5 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)
        5.1 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)
        5.2 HMR檢測(cè)方法
第三章 結(jié)果與分析
    1 載體的構(gòu)建
        1.1 目標(biāo)序列的設(shè)計(jì)
        1.2 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化與質(zhì)粒的測(cè)序
        1.3 載體完整性的驗(yàn)證
    2 轉(zhuǎn)基因植株的植物組織培養(yǎng)
    3 轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)
        3.1 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株
0代植株靶基因敲除位點(diǎn)初步檢測(cè)">        3.2 T₀代植株靶基因敲除位點(diǎn)初步檢測(cè)
第四章 結(jié)論與討論
    1 討論
        1.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)PTGMS2-1 基因定向突變的效果
        1.2 傳統(tǒng)的兩系不育系的育種方式與CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)基因突變的育種方式的優(yōu)劣
        1.3 下一步研究計(jì)劃
    2 結(jié)論
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄 主要試劑配方


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)及其在植物中的研究進(jìn)展[J]. 趙欣,胡軍.  中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào). 2015(12)
[2]光溫敏核不育水稻的研究進(jìn)展[J]. 陳云風(fēng).  宜春學(xué)院學(xué)報(bào). 2010(08)
[3]水稻兩用核不育系的育性光溫效應(yīng)及遺傳機(jī)理[J]. 劉海,陳立云.  作物研究. 2008(S1)
[4]水稻兩用核不育系研究進(jìn)展[J]. 楊燁,陳立云.  作物研究. 2008(S1)
[5]水稻兩用核不育系C815S的選育與利用[J]. 唐文邦,陳立云,肖應(yīng)輝,劉國(guó)華,鄧化冰.  湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2007(S1)
[6]應(yīng)用花培技術(shù)選育優(yōu)質(zhì)低溫敏水稻核不育系金山S-1[J]. 陳志偉,林荔輝,周元昌,潘潤(rùn)森,毛大梅,吳建梅,官華忠.  江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2005(05)
[7]溫度對(duì)兩系雜交水稻育性恢復(fù)的影響[J]. 謝國(guó)生,曾漢來(lái),林興華,陶愛(ài)林,張端品.  遺傳學(xué)報(bào). 2003(02)
[8]兩用核不育水稻的選育與利用研究進(jìn)展[J]. 廖亦龍,王豐,李傳國(guó),李曙光,柳武革,劉振榮,黃德娟.  作物研究. 2002(S1)
[9]中秈型優(yōu)質(zhì)光溫敏核不育系廣占63S的選育[J]. 楊振玉,張國(guó)良,張從合,陳金節(jié),王合勤,張金家,嚴(yán)志.  雜交水稻. 2002(04)
[10]實(shí)用早秈型兩用核不育系選育策略與進(jìn)展[J]. 楊遠(yuǎn)柱,唐平徠,符辰建,嚴(yán)革連.  作物研究. 2002(02)



本文編號(hào)：2927206