基因的原位編輯修飾一直被認為是生物學實驗中最困難也是最關(guān)鍵的部分,研究者通過對特定基因的原位編輯可以了解更多關(guān)于基因的功能、基因所調(diào)控的信號通路的細節(jié)。本文對于目的基因的原位編輯主要是通過CRISPR/Cas9技術(shù)將光轉(zhuǎn)蛋白基因序列敲入果蠅的多個基因位點中。從細菌中發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在許多生物體中被證明是非常高效強大的基因編輯工具。成規(guī)律的成簇的非連續(xù)的短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是一類在細菌中發(fā)現(xiàn)的DNA片段,在這些片段中包含了來自于攻擊過這類細菌的病毒的DNA片段。這些片段最初是被細菌用來檢測和摧毀含有與之相似序列的病毒,其和CRISPR相關(guān)蛋白（CRISPR-associated protein,Cas）構(gòu)成了細菌的防御免疫系統(tǒng)。人們通過基因工程改造了Ⅱ型的CRISPR/Cas系統(tǒng)即我們所稱的CRISPR/Cas9系統(tǒng),使得基因的原位編輯效率大大提高。形成素基因是TGF-β信號通路的配體,其調(diào)控生物體發(fā)育,pattern的形成和干細胞的分化。它們的產(chǎn)... 

【文章來源】：福州大學福建省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：52 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

圖１－１?ＺＦＮ基因編輯原理簡圖（引自網(wǎng)絡(luò)）??

于免疫記憶中的記憶Ｔ細胞，當含有同樣序列的外源ＤＮＡ再次入侵時，該外源ＤＮＡ??可以被細菌的ＣＲ１ＳＰＲ免疫機制識別，并進行剪切使得外源ＤＮＡ表達沉默，進而達??到保護細菌自身安全的目的（圖１－４）。在這里行使ＤＮＡ剪切功能的是ＣＲＩＳＰＲ相??關(guān)蛋白９，在Ｃａｓ９上有２個酶切活性位點可以切割ＤＮＡ，其靶向介質(zhì)是ＲＮＡ，我們將??其稱為向?qū)В遥危?（ｇＲＮＡ）。??除了主角Ｃａｓ９外，還有一些其他的Ｃａｓ蛋白，也會促進ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)的編??輯能力。例如：幫助獲得新的重復(fù)序列的Ｃａｓｌ和Ｃａｓ２蛋白；具有解旋酶和核酸酶??功能的Ｃａｓ３蛋白。當然也有一些Ｃａｓ蛋白的功能目前尚且不太清楚。???Ａ?ＣＲＩＳＰＲ?Ｌｏｃｕｓ???Ｓｐａｃｅｒｓ??／?１?＼??＇ｆ?＼?＂＼｛???＃??＂???、??Ｖ?ｋ?Ｊ?ｇ??ＣＡＳ?Ｇｅｎｅｓ?Ｌｅａｄｅｒ?＼?＼?／?／??Ｒｅｐｅａｔｓ??Ａ?ＣＲＩＳＰＲ?Ａｒｒａｙ??圖卜４?ＣＲＩＳＰＲ的序列結(jié)構(gòu)簡圖（引自網(wǎng)絡(luò)）Ｌｅａｄｅｒ：位于ＣＲＩＳＰＲ簇上游，富含ＡＴ序列，長度約??３００－５００ｂｐ，可能是啟動子．Ｒｅｐｅａｔ：為重復(fù)序列區(qū)，其長度約為２１？４８ｂｐ，并且其中含有回文序列，可以??形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)．Ｓｐａｃｅｒ：即重復(fù)序列中的間隔區(qū)域，其長度約為２６？７２ｂｐ，由被俘獲的外源ＤＮＡ組成．ＣＡＳ??Ｇｅｎｅｓ：編碼ＣＲＩＳＰＲ相關(guān)Ｃａｓ蛋白基因．??１．３．?３?ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系統(tǒng)的基因原位編輯機制原理??前文我們提到過目前人們發(fā)現(xiàn)了三種不同類型的ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)，其中由于ＩＩ??型ＣＲＩＳＰＲ系統(tǒng)比較簡單

比例選取果蠅提基因組并進行第一輪分子鑒定。本課題的果蠅第一輪分子鑒定的??陽性標簽是ＫＩ片段中ｄｅｎｄｒａ蛋白核酸序列中的一部分（引物設(shè)計位點見圖??３－１，３－６，?３－９）。??（３）若第一輪分子鑒定出現(xiàn)陽性管，則從每個陽性管中分別再挑選１０只Ｆ１Ｒ??雄蠅，再次與雙平衡子品系一對一雜交，待其有后代后，對父母本中的雄蠅（原??Ｆ１代雄蠅）進行第二輪分子鑒定。第二輪分子鑒定引物設(shè)計位點為原同源臂５’??端上游３０（＾口處和同源臂３’端下游３０（＾口處（圖３－１，３－５，３－８）。為降低？〇？??難度，可將第二輪分子鑒定引物與第一輪分子鑒定引物結(jié)合使用。以Ｄｐｐ為例（圖??３－１），第二輪分子鑒定的目的片段：５’端ｆｌａｎｋ?（使用５’ＤｐｐＦＰ，ｄｅｎｄｒａＲＰ這對??弓丨物）３’端ｆｌａｎｋ（使用ｄｅｎｄｒａＦＰ，?３’?ＤｐｐＲＰ這對引物）。??（４）若第二輪分子鑒定出現(xiàn)陽性管，將陽性管的ＰＣＲ產(chǎn)物５’端Ｈａｎｋ和３’端??ｆｌａｎｋ送測序，確認其不是脫靶的ＫＩ陽性品系，并確認其沒有發(fā)生移碼或錯義??突變。??（５）完成鑒定后，從第二輪分子鑒定陽性管中挑選類似ＫＩ／平衡子的基因型保??種，并將含有相同平衡子的ＫＩ／平衡子果蠅進行一對一雜交，構(gòu)建純合的ＫＩ??果繩品系。??

【參考文獻】：
期刊論文
[1]TALENs:植物基因組定點剪輯的分子剪[J]. 趙開軍,楊兵.  中國農(nóng)業(yè)科學. 2012(14)
[2]鋅指蛋白核酸酶的作用原理及其應(yīng)用[J]. 鐘強,趙書紅.  遺傳. 2011(02)



本文編號：2919924