川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）為四川省著名的道地藥材,具有祛風(fēng)止痛、活血行氣的功效,其指標(biāo)成分為川芎嗪和阿魏酸,常用于治療心腦血管、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等方面的疾病。目前已從多種植物中分離得到α-淀粉酶抑制劑,其在減肥、降血脂、治療糖尿病和抗蟲害等方面都有應(yīng)用。本課題以川芎根莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),篩選出一條可能的α-淀粉酶抑制劑基因。采用RACE技術(shù)成功擴(kuò)增出該基因的全長序列,命名為Ligusticumchuanxiongα-amylase Inhibitor （LASI）。基因序列上傳至NCBIGenBank數(shù)據(jù)庫,登錄號為KX580040。對LASI蛋白的基本性質(zhì)分析結(jié)果顯示:LASI基因全長860bp,含612bp的CDS,編碼203aa的蛋白質(zhì)。其相對分子質(zhì)量為22570Da,理論等電點(diǎn)為5.06,無明顯的親疏水性。LASI的1-23位氨基酸殘基為信號肽,無跨膜結(jié)構(gòu)域,亞細(xì)胞定位于胞外。通過與其他植物的α-淀粉酶抑制劑和胰蛋白酶抑制劑進(jìn)行多序列比對后發(fā)現(xiàn),LASI屬于Kuntize型α-淀粉酶抑制劑,具有α-淀粉酶抑制劑和枯草桿菌蛋白酶抑制劑活性。LA... 

【文章來源】：西南交通大學(xué)四川省 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：79 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 緒論
    1.1 川芎簡介
    1.2 川芎的藥理作用
        1.2.1 對心腦血管的作用
        1.2.2 對神經(jīng)系統(tǒng)的作用
        1.2.3 對呼吸系統(tǒng)的作用
        1.2.4 對泌尿系統(tǒng)的作用
        1.2.5 其他作用
    1.3 A-淀粉酶抑制劑
        1.3.1 非蛋白質(zhì)類
        1.3.2 多肽類
        1.3.3 Lectin type
        1.3.4 Knottin type
        1.3.5 Cereal type
        1.3.6 Kuntize type
        1.3.7 γ-Purothionin type
        1.3.8 Thaumatin type
    1.4 A-淀粉酶抑制劑的功能和應(yīng)用
        1.4.1 健康與疾病預(yù)防方面
        1.4.2 防治蟲害方面
        1.4.3 對抗非生物脅迫方面
    1.5 課題的研究內(nèi)容、意義和技術(shù)路線
        1.5.1 研究內(nèi)容
        1.5.2 本研究的意義
        1.5.3 本課題的技術(shù)路線
第2章 川芎LASI基因的克隆及生物信息學(xué)分析
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株與載體
        2.1.3 其他試劑
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 RNA的提取及cDNA的合成
        2.2.2 3'端RACE
        2.2.3 5'端RACE
        2.2.4 LASI的全長CDS克隆
    2.3 生物信息學(xué)分析
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 RNA提取
        2.4.2 3'端RACE和5'端RACE
        2.4.3 LASI全長CDS克隆
        2.4.4 理化性質(zhì)分析
        2.4.5 親/疏水性分析
        2.4.6 跨膜結(jié)構(gòu)域分析
        2.4.7 信號膚分析
        2.4.8 亞細(xì)胞定位預(yù)測
        2.4.9 氨基酸序列比對分析
        2.4.10 分子進(jìn)化樹分析
        2.4.11 密碼子偏好性分析
        2.4.12 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        2.4.13 功能結(jié)構(gòu)域分析
        2.4.14 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測
        2.4.15 LASI初始模型的優(yōu)化
    2.5 本章小結(jié)
第3章 LASI的原核表達(dá)與純化
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 菌種與質(zhì)粒
        3.1.2 試劑及材料
    3.2 實(shí)驗(yàn)方法
        3.2.1 LASI基因片段的制備
        3.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.3 LASI的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.2.4 原核表達(dá)條件的優(yōu)化
        3.2.5 可溶性檢測
        3.2.6 LASI蛋白的純化
        3.2.7 純化蛋白的鑒定
    3.3 結(jié)果與討論
        3.3.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.3.2 LASI的誘導(dǎo)表達(dá)
        3.3.3 原核表達(dá)條件的優(yōu)化
        3.3.4 可溶性檢測
        3.3.5 LASI蛋白的純化與鑒定
    3.4 本章小結(jié)
第4章 LASI的活性檢測
    4.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.1.1 昆蟲材料
        4.1.2 其他試劑
    4.2 實(shí)驗(yàn)方法
        4.2.1 LASI純化蛋白濃度的測定
        4.2.2 昆蟲淀粉酶的提取
        4.2.3 α-淀粉酶抑制活性檢測
        4.2.4 枯草桿菌蛋白酶抑制活性檢測
        4.2.5 胰蛋白酶抑制活性檢測
        4.2.6 胰凝乳蛋白酶抑制活性檢測
    4.3 結(jié)果與討論
        4.3.1 LASI純化蛋白的濃度
        4.3.2 α-淀粉酶抑制活性
        4.3.3 蛋白酶抑制活性
    4.4 本章小結(jié)
第5章 LASI的表達(dá)模式分析
    5.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 其他試劑
    5.2 實(shí)驗(yàn)方法
        5.2.1 川芎植物脅迫處理
        5.2.2 RNA的提取與cDNA的合成
        5.2.3 特異引物的檢測
        5.2.4 RT-qPCR擴(kuò)增
    5.3 結(jié)果與討論
        5.3.1 脅迫組織RNA提取
        5.3.2 特異性引物檢測
        5.3.3 川芎LASI基因的表達(dá)模式分析
    5.4 本章小結(jié)
結(jié)論
致謝
參考文獻(xiàn)
攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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碩士論文
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本文編號：2898045