真核翻譯延伸因子(eukaryotic translation elongation factor,eEFs)是一種重要的多功能調(diào)控蛋白。eEFs可以與多種病毒的蛋白、病毒RNA及基因組的非編碼區(qū)(UTR)發(fā)生相互作用,從而有利于病毒完成生活史。eEF1B作為eEF家族的重要成員,其與病毒的互作研究還相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)室在我國(guó)冬小麥上鑒定了一種由禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)傳播的新病毒—中國(guó)小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV),并在其分子生物學(xué)上取得了一些進(jìn)展,但在其與宿主相互作用等領(lǐng)域研究尚少。因此,本研究首先克隆了小麥eEF1B的基因,并進(jìn)行同源性分析和表達(dá)特性分析,然后基于CWMV侵染性克隆分析了CWMV與宿主eEF1B的互作關(guān)系,并取得了以下結(jié)果:首先,本研究通過RT-PCR擴(kuò)增克隆了小麥的eEF1B,并命名為TaeEF1B。同源性分析發(fā)現(xiàn)TaeEF1B具有高度保守性,其保守結(jié)構(gòu)域位于137-226 aa處。組織特異性表達(dá)分析表明TaeEF1B在小麥莖部具有較高的表達(dá)水平。另外,本研究也構(gòu)建了TaeEF1B的原核表達(dá)載體并進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá),獲得TaeEF1B純化蛋白,為研究其在CWMV侵染過程中的功能奠定基礎(chǔ)。然后,利用CWMV的侵染性克隆在模式植物本氏煙(Nicotiana benthamiana,Nb)中分析了CWMV和NbeEF1B之間的關(guān)系。通過qPCR和Northern blotting實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在本氏煙中NbeEF1B的基因沉默抑制CWMV CP和基因組RNAs的積累。反之,在本氏煙中NbeEF1B的瞬時(shí)過表達(dá)促進(jìn)CWMV CP和基因組RNAs的積累,表明NbeEF1B正調(diào)控CWMV的復(fù)制。進(jìn)一步通過酵母雙雜交(Yeast two-hybrid,Y2H)、凝膠電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic Mobility Shift Assay,EMSA)實(shí)驗(yàn)分析TaeEF1B與CWMV的互作方式。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)TaeEF1B與CWMV的RdRp之間存在相互作用;EMSA實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)TaeEF1B能特異性地結(jié)合CWMV 3’UTR區(qū),表明TaeEF1B可能通過與CWMV 3’UTR區(qū)的結(jié)合作用從而促進(jìn)病毒復(fù)制。這些結(jié)果為進(jìn)一步分析TaeEF1B促進(jìn)CWMV復(fù)制的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：浙江農(nóng)林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S432.41
【部分圖文】：

1.2.2 CWMV 病毒基因組結(jié)構(gòu)CWMV 病毒粒子呈桿狀，直徑約為 20nm、長(zhǎng)度 80-360nm 不等，主要為 150 nm~300 nm，且短粒子較多。CWMV 為單鏈正義 RNA 病毒（ssRNA），包含兩條基因組，分別命名為 RNA1 和 RNA2（圖 1.1）。RNA1 大小為 7147 nt,含有 3 個(gè)開放閱讀（OpenRead Frame, ORF）其中 ORF1 編碼一個(gè) 153 kDa 的多肽，其 UGA 終止密碼子能以一定比例通讀(Read-through，RT)至 ORF2，產(chǎn)生一個(gè)含 RNA 聚合酶(RNA-dependentRNA polymerase，RdRp)，約為 212 kDa 的通讀產(chǎn)物。ORF3 編碼一個(gè) 37 kDa 的運(yùn)動(dòng)蛋白(movement protein，MP)[95]。CWMV RNA2 大小為 3569 nt，含有 3 個(gè) ORF，ORF1編碼一個(gè) 19 kDa 的外殼蛋白(Coat Protein，CP)，它的終止密碼子 UGA 可部分通讀開放閱讀框，產(chǎn)生一個(gè) 84 kDa 的通讀蛋白(CP-RT)；19 kDa CP 的起始密碼子 AUG 之前的一個(gè)密碼子 CUG，也可以作為起始密碼子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生一個(gè)約為 23 kDa 的蛋白質(zhì)，與正常的 CP 蛋白相比，其 N 端多 40 個(gè)氨基酸，稱為 N-CP。ORF3 編碼一個(gè)富含半胱氨酸蛋白(Cystein rich protein,CRP)，約 19 kDa[95]。

圖 2.1 TaeEF1β 重組質(zhì)粒檢測(cè)圖.1 Identification of recombinant vector plasmids of Ta注：M：8000bp DNA Ladder；1：TaeEF1BNote:M:8000bp DNA Ladder；1:TaeEF1B源序列的分析eEF1B 基因的 ORF 區(qū)域氨基酸序列，用 BL(Oryza sativa，Os)、大麥 (Barley，Ba)、玉olor，Sb)、煙草 (Nicotiana benthamiana，N白，其在 NCBI 中的登錄號(hào)分別為：XP_0151B)，NP_001149263.1(ZmeEF1B)，XP_002eEF1B)。利用 DNAMAN 軟件將 TaeEF1B 與，比對(duì)結(jié)果顯示這些不同物種間的 eEF1B .A）。用 smart 軟件分析該蛋白的結(jié)構(gòu)特征（模服務(wù)系統(tǒng)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)（圖 2.2.C7-226aa。

19圖 3 (A)TaeEF1B 基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)；(B)保守結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)；(C)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型。Fig.3 (A) The secondary structure of TaeEF1B;(B)The conservative structural domain prediction; (C)The protein structure model of TaeEF1B.注：A： ；helix： ；strand； ：coli；B： ：（137-226aa）保守結(jié)構(gòu)域Note:A： ；helix： ；strand； ：coli；B： ：The conservative structure domain of (137-226aa)
【參考文獻(xiàn)】

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1 孫炳劍;羊健;孫麗英;程兆榜;謝禮;姜鴻明;鄭建強(qiáng);趙倩;謝聯(lián)輝;陳劍平;;禾谷多黏菌傳小麥病毒病的分布及變化動(dòng)態(tài)[J];麥類作物學(xué)報(bào);2011年05期

2 馮愛花;陳宗梅;李靜;程備久;范軍;;玉米葉綠體鐵氧還蛋白1的原核表達(dá)及部分性質(zhì)分析[J];核農(nóng)學(xué)報(bào);2011年01期

3 倪志勇;李波;范玲;;棉花肉桂醇脫氫酶基因GhCAD3的克隆及原核表達(dá)[J];核農(nóng)學(xué)報(bào);2010年05期

4 于在江;馬學(xué)恩;周建華;;切膠純化表達(dá)蛋白包涵體的可行性分析[J];生物技術(shù);2007年03期

本文編號(hào)：2881640