菲牛蛭Hirudinariamanillensis隸屬于蛭綱無(wú)吻蛭目醫(yī)蛭科牛蛭屬,是一種在多個(gè)國(guó)家廣泛分布的吸血水蛭。菲牛蛭在吸血時(shí)唾液腺可以分泌多種高效的抗凝血活性成分,具有巨大的藥用潛力,近年來(lái)受到了人們的重點(diǎn)關(guān)注。目前對(duì)于菲牛蛭的研究多集中于分類(lèi)、人工養(yǎng)殖、生物活性成分的提取及鑒定等方面,基因和遺傳學(xué)研究的欠缺制約了人們對(duì)這種重要藥用動(dòng)物的了解及其藥用研究進(jìn)程。本研究通過(guò)對(duì)兩種處理?xiàng)l件下菲牛蛭轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析,為揭示菲牛蛭吸血習(xí)性相關(guān)機(jī)制及挖掘抗凝血新基因提供了新的證據(jù)。本研究利用Illumina HiSeq X Ten測(cè)序平臺(tái)對(duì)菲牛蛭吸血前和吸血后兩個(gè)狀態(tài)的樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,對(duì)比了吸血前后菲牛蛭體內(nèi)基因表達(dá)及相關(guān)代謝通路的變化,并對(duì)菲牛蛭吸血習(xí)性相關(guān)的三大類(lèi)功能基因進(jìn)行了深入挖掘。不僅闡明其吸血機(jī)制,還為菲牛蛭的藥物開(kāi)發(fā)提供了可靠的分子基礎(chǔ)。最后,利用qRT-PCR對(duì)與11個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了表達(dá)量的驗(yàn)證。研究結(jié)果和主要結(jié)論如下:1.構(gòu)建了菲牛蛭吸血前后兩個(gè)cDNA文庫(kù),經(jīng)測(cè)序獲得了總量為14.06 Gb的Clean data。進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組合并組裝和拼接后,共獲得55,998條總長(zhǎng)度為37,208,146 bp 的 Unigene,其 GC 值為 43.70%,N50 為 1,391 bp,平均長(zhǎng)度為 664.45 bp。2.將 All-Unigene 與 NR、KEGG、Pfam、COG、KOG、eggNOG4.5、Swiss-prot以及GO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)后,共注釋了 26,469條Unigene。其中,在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中基因的注釋數(shù)目最多,占了已注釋Unigene總數(shù)的75.58%,其中與澤蛭Helobdella robusta之間存在的同源序列最豐富。3.研究最終共獲得40,603個(gè)CDS,長(zhǎng)度介于100到1,000 bp范圍內(nèi)的CDS最多,共有35,009條,占比為84.16%。而長(zhǎng)度為2,000 bp以上的CDS最少,僅有1,623條,占比為2.74%。4.對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行RPKM標(biāo)準(zhǔn)化處理,并嚴(yán)格控制篩選標(biāo)準(zhǔn)(FDR≤0.01且差異倍數(shù)FC≥2),發(fā)現(xiàn)菲牛蛭吸血前、后共有2,371個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá),其中有892個(gè)基因的表達(dá)量在吸血后發(fā)生上調(diào),1,479個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生下調(diào)。共有485個(gè)差異基因在GO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得了功能注釋,其中與能量代謝、蛋白質(zhì)合成過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)和免疫過(guò)程相關(guān)的基因數(shù)量最多。對(duì)兩組樣品間的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG pathway分析顯示:共有535個(gè)差異表達(dá)基因獲得了注釋并且涉及到174條代謝通路,顯著富集的KEGG通路包括氧化磷酸化、核糖體代謝通路和MAPK信號(hào)通路等。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),在氧化磷酸化通路中,多個(gè)與電子傳遞鏈復(fù)合體相關(guān)的基因發(fā)生了下調(diào),產(chǎn)能減弱。與此同時(shí),多個(gè)與核糖體代謝途徑相關(guān)的基因表達(dá)量發(fā)生上調(diào)。表明菲牛蛭吸血后代謝過(guò)程減弱,蛋白質(zhì)合成過(guò)程顯著增強(qiáng)。5.基于吸血?jiǎng)游镌谖^(guò)程中所具有的特點(diǎn),選擇了三個(gè)基因家族的基因進(jìn)行挖掘,包括抗凝血相關(guān)的功能基因、涉及到免疫反應(yīng)的功能基因以及涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)的功能基因。結(jié)果顯示,菲牛蛭在吸血后,與抗凝血、免疫、氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著提高,這表明菲牛蛭的抗凝血反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及應(yīng)激反應(yīng)都顯著增強(qiáng),在吸血過(guò)程中使得菲牛蛭可以順利吸血,并且抵抗細(xì)菌的侵襲以及血紅素的氧化脅迫。6.利用qRT-PCR對(duì)水蛭素(Hirudin)、乳清酸(Saratin)、凝血因子抑制劑(Antistasin)、蛋白酶抑制劑(Guamerin)、ATP 二磷酸水解酶(Apyrase)、失穩(wěn)酶(Destabilase)、C型凝集素(Lectin C)、蛋白酶抑制劑(EglinC)以及血清纖維凝膠蛋白(Ficolin)的11個(gè)編碼基因進(jìn)行了表達(dá)量的驗(yàn)證。結(jié)果表明,qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果基本一致,證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的可靠性。
【學(xué)位單位】：陜西師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類(lèi)】：Q953
【部分圖文】：

圖１－１水輕抗凝血?jiǎng)┑淖饔渺朦c(diǎn)。其中１表示Ａｎｔｉｓｔａｓｉｎ、Ｇｈｉｌａｎｔｈｅｎ和Ｔｈｅｒｏｓａｓｉｎ；２表示Ｈｉｒｕｄｉｎ、??Ｈａｅｍｅｎｄｉｎ?和?Ｂｕｆｒｕｄｉｎ；?３?表示?Ｃａｌｉｎ；?４?表示?Ｄｅｃｏｒｓｉｎ；?５?表示?Ｈｅｍｅｎｔｉｎ?和?Ｄｅｓｔａｂｉｌａｓｅ；?６?表??示?Ｈｅｍｅｎｔｅｒｉｎ??Ｆｉｇ?１－１?Ｔａｒｇｅｔｓ?ｏｆ?ｌｅｅｃｈ?ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ．?１：?Ａｎｔｉｓｔａｓｉｎ，?Ｇｈｉｌａｎｔｈｅｎ，?Ｔｈｅｒｏｓａｓｉｎ；?２：?Ｈｉｒｕｄｉｎ，??Ｈａｅｍｅｎｄｉｎ，?Ｂｕｆｒｕｄｉｎ；?３：?Ｃａｌｉｎ；?４：?Ｄｅｃｏｒｓｉｎ；?５：?Ｈｅｍｅｎｔｉｎ，?Ｄｅｓｔａｂｉｌａｓｅ；?６：?Ｈｅｍｅｎｔｅｒｉｎ．??１．７研究?jī)?nèi)容及研究意義??１．７．１研究?jī)?nèi)容??菲牛蛭作為一種具有重大藥用價(jià)值和養(yǎng)殖潛力的水蛭物種，目前相關(guān)的轉(zhuǎn)錄??組和基因組的相關(guān)研宄未見(jiàn)報(bào)道。本研究利用Ｉｌｌｕｍｉｎａ?ＨｉＳｅｑ?Ｘ?Ｔｅｎ測(cè)序平臺(tái)對(duì)菲??牛蛭吸血前、后兩組樣本進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)組裝得到的菲牛蛭Ａｌｌ－Ｕｎｉｇｅｎｅ進(jìn)??行了全局分析。之后采用差異表達(dá)分析法探究了吸血前、后菲牛蛭發(fā)生的基因表??達(dá)量和相關(guān)代謝通路的變化，并且對(duì)差異基因進(jìn)行了功能基因挖掘。最后，利用??ｑＲＴ－ＰＣＲ對(duì)與抗凝血過(guò)程及免疫反應(yīng)相關(guān)的１１個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了表達(dá)量的驗(yàn)??證。??

圖２－１?ｃＤＮＡ文庫(kù)構(gòu)建示意圖??Ｆｉｇ?２－１?Ｆｌｏｗｃｈａｒｔ?ｏｆ?ｃＤＮＡ?ｌｉｂｒａｒｙ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ??文庠的Ｉｌｌｕｍｉｎａ高通量測(cè)序??庫(kù)建庫(kù)完成后，委托Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ?Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司對(duì)ｉｎａ公司的Ｈｉｓｅｑ?Ｘ?Ｔｅｎ測(cè)序平臺(tái)完成高通量測(cè)序”方式，即對(duì)ｃＤＮＡ文庫(kù)中的每條序列都從兩端（５啷３ｃＤＮＡ序列便可以獲得兩個(gè)長(zhǎng)度為１００?ｂｐ的讀序（ｒ會(huì)相互識(shí)別，形成一對(duì)對(duì)ｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ?ｒｅａｄｓ。??程??數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)??序所得的數(shù)據(jù)由圖像形式轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，叫做Ｒａｗ格式為ｆａｓｔｑ。ｆａｓｔｑ格式的文件存儲(chǔ)著每條ｒｅａｄｓ的序

第２章實(shí)驗(yàn)材料與方法菲牛蛭Ｕｎｉｇｅｎｅ的拼接組裝??得菲牛蛭Ｃｌｅａｎ?ｒｅａｄｓ之后，使用Ｔｒｉｎｉｔｙ軟件對(duì)其進(jìn)行無(wú)參考基因（也ｗｏｗ?ａｓｓｅｍｂｌｙ）。Ｔｒｉｎｉｔｙ軟件的組裝過(guò)程分為以下三步：??（１）首先將測(cè)序Ｒｅａｄｓ打斷來(lái)構(gòu)建Ｋ－ｍｅｒ庫(kù)，進(jìn)而形成Ｃｏｎｔｉｇ；??（２）用Ｃｏｎｔｉｇ進(jìn)行聚簇得到Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ，并構(gòu)建Ｄｅ?Ｂｒｕｉｊｎ圖；??３）對(duì)ＤｅＢｒｕｉｊｎ圖進(jìn)行優(yōu)化，獲得轉(zhuǎn)錄本序列。得到盡可能長(zhǎng)的非（Ａｌｌ－Ｕｎｉｇｅｎｅ）?〇??
【參考文獻(xiàn)】

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